(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210724734.9 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 中国农业大 学西校区 (72)发明人 朱元娣　郭静　赵芫　潘琦　褚宇　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种与苹果柱形树形性状紧密连锁的分子 标记及其应用 (57)摘要 本发明作物育种技术领域， 具体涉及一种 与 苹果柱形树形性状紧密连锁的分子标记及其应 用。 本发明基于Gypsy ‑44和Gypsy ‑33的序列开发 的2对引物， 鉴定的柱型性状基因型与实际性状 高度符合， 说明Co区域中的Gypsy ‑44与苹果树柱 型性状密切连锁。 本发明设计的分子标记及其引 物， 可直接用于苹果柱型基因型的早期筛选和精 准鉴定。 本发明提供的方法简单高效， 经过一次 PCR和凝胶电泳即可高准确率地鉴定苹果个体的 纯合柱形树形、 杂合柱形树形及纯合非柱形树形 的基因型。 此外， 本发明鉴定的纯合柱形树形后 代可作为柱型苹果资源， 用于 “树型和品质 ”兼具 的苹果新品种的进一步续选育， 提高了苹果新品 种的选育效率。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 115011727 A 2022.09.06 CN 115011727 A 1.一种鉴定苹果的树形基因型的分子标记， 其序列如SEQ  ID NO： 4所示。 2.权利要求1所述的分子标记在苹果育种中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 包括对苹果树形进行预测和/或对苹果种 植资源进行鉴定 。 4.检测权利要求1所述分子标记的引物组合。 5.根据权利 要求4所述的引物组合， 其特征在于， 包括： 具有如SEQ  ID NO:1所示序列的 引物F1、 具有如SEQ  ID NO:2所示序列的引物R 1和具有如SEQ  ID NO:3所示序列的引物R2。 6.一种苹果树形基因型的鉴定方法， 其特征在于， 包括检测权利要求1所述的分子标 记。 7.根据权利要求6所述的鉴定方法， 其特 征在于， 所述检测包括： 用权利要求4所述的引物组合对苹果基因组进行扩增， 根据扩增产物判断苹果的树形 基因型。 8.根据权利要求7 所述的鉴定方法， 其特 征在于， 所述判断包括： 1)扩增产物中不含有SEQ  ID NO： 4所示的序列， 则所测苹果 为纯合隐性非柱状树形； 2)扩增产物中都含有SEQ  ID NO： 4所示的序列， 则所测苹果 为纯合显性柱状树形； 3)扩增产物含有两种片段， 其 中一种不含有SEQ  ID NO： 4所示序列的片段， 另一种含有 SEQ ID NO： 4所示序列的片段， 则所测苹果 为杂合显性柱状树形。 9.根据权利要求7或8所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述扩增的引物为权利要求5所述 的引物组合； 所述 鉴定扩增产物的方法为电泳； 所述判断的方法为： i)扩增产物不包括长度为510bp的片段， 则所测苹果 为纯合隐性非柱状树形； ii)扩增产物不包括长度为282bp的片段， 则所测苹果 为纯合显性柱状树形； iii)扩增产物的包括282bp和510bp的片段， 则所测苹果 为杂合显性柱状树形。 10.一种鉴定检测苹果树形基因型的试剂盒， 其特征在于， 包括PCR扩增试剂和权利要 求4所述的引物组合。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011727 A 2一种与苹果柱形树形性状紧密连锁的分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子标记辅助作物育种技术领域， 具体涉及 一种与苹果柱形树形性状 紧密连锁的分子标记及其应用。 背景技术 [0002]苹果栽培历史悠久， 是世界范围内的最重要经济作物 之一。 近年来， 我国苹果产业 在稳定生产面积的基础上， 致力提高苹果品质和建立省力化栽培管理模式。 柱型是苹果树 的一种树型， 在种植生产中具有相当的优势。 柱型苹果树比短枝型、 普通型、 和垂枝型更易 实现省力化栽培和密植， 而且柱型苹果树的单位面积的产量比较高， 高于M9矮化砧木的苹 果树。 苹果的 “矮化密植 ”是苹果产业发展趋势， 然而通过常规有性杂交传育种手段难以培 育出兼具“柱型和优良品质 ”的新品种。 因此， 需要通过分子 育种培育优良的柱型品种。 [0003]分子标记辅助育种是一种常用的育种方式， 通过检测 分子标记， 即可检测到目的 基因的存在。 这种方式可以选择目标性状， 具有 快速、 准确、 不受环 境条件干扰的优点。 如果 分子标记与目的性状决定基因位置越相 近， 则在繁殖的过程中， 其发生重组而分离的概率 也就越小， 连锁程度也就越高， 鉴定所得个体的目的性状的稳定性也就越好。 分子标记辅助 育种的难点在于不清楚分子标记与目的基因的精确位置和关系， 筛选得到与目的性状决定 基因紧密连锁的分子标记并不 容易。 [0004]可以基于现有的苹果树柱型性状的基 因标记和定位方面的研究， 筛选合适的分子 标记。 经典遗传学试验证明， 苹果树的柱型生长性状(columnar  gr owth habit)受单性基 因位点的显性控制， 具有遗传稳定性， 并将相关区域命名为Co。 Conner等于1997年基于苹果 有性杂交群体构建的遗传图谱， 利用R  APD标记将Co定位于苹果树的 ‘White Angel’10号连 锁群上。 此后， Tian等人于2012年左右开发了与苹果树柱型性状紧密连锁的AFLP、 SSR等分 子标记， 将Co基因精确定位至苹果10号染色体的18.51 ‑19.91Mb区域内。 随后Otto等于2 014 左右， 基于柱型苹果树 ‘威赛克’品种， 于Co区域内发现Gy  psy‑33反转座子(3.9kb)的5 ’LTR 区域内插入了Gypsy ‑44反转录转座子(8.2kb)， 这与柱型突变有关。 柱型和非柱型苹果树均 含有Gypsy ‑33反转座子， 然而柱型苹果树中含有Gypsy ‑44反转座子， 非柱型苹果树中则 不 含有。 综上， 苹果树柱型性状受单性基因位点控制， 且与位于10号染色体的18.51 ‑19.91M的 Co区域密切相关。 更进一步地， 存在一种可能性： 苹果树柱型性状决定基因与Gypsy ‑44转座 子距离较近， Gypsy ‑44与苹果柱型性状紧密连锁。 基于这种可能性， 可尝试利用Gypsy ‑44及 其插入Gypsy‑33的核酸序列设计D  NA分子标记， 用以辅助柱型性状苹果的遗传育种。 [0005]问题在于， 决定苹果树柱型的具体基因及其精确的遗传位点并不清楚， Gypsy ‑44 相关核酸序列能否用作 与苹果树柱型性状的分子标记有必要 进行更进一步地探索。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明要解决的问题 是探索Gypsy ‑33中插入的Gypsy ‑44转座子与苹果 树柱型性性状之 间的关系， 并基于此设计一种DNA分子标记用于遗传育种。 本发明提供了一说　明　书 1/5 页 3 CN 115011727 A 3