(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210960608.3 (22)申请日 2022.08.11 (71)申请人 青岛农业大 学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人 马长青　王彩虹　王梦琪　王旭　 田义轲　王栋　郑晓东　孙志娟　 (74)专利代理 机构 北京云嘉 湃富知识产权代理 有限公司 1 1678 专利代理师 谢子运 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及 其筛选方法 (57)摘要 本发明属于分子标记 技术领域， 公开了一种 与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方 法。 所述筛选分子标记方法包括： 获得杂交组合 的F1代群体； 基因组DNA的提取纯化及混池构建； BSA‑seq分析； SSR分子标记的鉴定。 本发明通过 BSA‑seq技术， 筛选与目的基因紧密连锁的分子 标记， 利用所获得的分子标记， 便于对目标性状 的早期选 择， 为挖掘决定目标性状的候选基因和 解析梨花粉败育性状形成的分子机制打下基础， 为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供 重要的理论依据。 本发明有利于对目标性状的早 期选择， 为挖掘决定目标性状的候选基因和解析 梨花粉败育性状形成的分子 机制打下基础。 权利要求书3页 说明书11页 附图1页 CN 115261504 A 2022.11.01 CN 115261504 A 1.一种与梨花粉败育性状相关联分子标记， 其特征在于， 所述与梨花粉败育性状相关 联分子标记位 点为SSR1； 正向引物序列为SEQ  ID NO： 1， 反向引物序列SEQ  ID NO： 2。 2.根据权利要求1所述的与梨花粉败育性状相关联分子标记， 其特征在于， 所述与梨花 粉败育性状相关联分子标记为25 0bp； 在基因组中的位置： 201 18415～20118425。 3.一种利用BSA ‑seq筛选如权利要求1 ‑2任意一项所述与梨花粉败育性状相 关联分子 标记的方法， 其特征在于， 该利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法包括 以下步骤： S1， 获得新梨7号和中香杂交 组合的F1代群体； S2， 基因组DNA的提取纯化及对比基因池的构 建： 根据杂交后代花粉败育性状的调查结 果， 选取花粉败育和可育植株， 提取基因组DNA， 并按照DNA等量原则构建花粉败育/可育性 状的对比基因池B1和B2； S3， BSA‑seq分析： 对两个亲本及子代基因池B1、 B2样本进行BSA ‑seq， 比对参考基因组， 筛选与花粉 败育性状相关的S SR分子标记； S4， SSR分子标记的鉴定： 比对参 考基因组， 筛选与花粉 败育性状相关的S SR分子标记。 4.根据权利 要求3所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其 特征在于， 在步骤S2中， 所述基因 组DNA的提取 方法包括以下步骤： (1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g， 装入样品袋中， 做好标记并放到 ‑80℃的超低温冰箱内 保存， 以备DNA提取用； (2)将内含2％CTAB 的提取缓冲液CTAB  buffer事先在65℃预热， 然后取800μL加入到 2mL的离心管内， 在6 5℃下保温； (3)将植物材料放入研钵中， 加入液氮迅速研磨成粉末状， 并迅速转移到装有预热的提 取缓冲液的离心管内， 上 下颠倒混匀， 并放在6 5℃水浴锅中保温20mi n， 多次颠倒混匀； (4)将离心管取出， 加体积比为24： 1的800 μL 氯仿： 异戊醇， 颠倒充分混合， 温和震荡2～ 3min， 在高速 离心机上140 00rpm离心10mi n； (5)将上清液转移到1.5mL离心管中， 加入6 μL  10mg·mL‑1的RNase充分颠倒混匀， 放在 37℃恒温箱内温育1h， 用体积比为24： 1的氯仿： 异戊醇抽提1次； (6)将上清液转移到1.5mL离心管中， 加500μL事先在 ‑20℃冰箱内预冷的异丙醇， 上下 颠倒混匀后， 于 ‑20℃冰箱中沉淀DNA  10min； (7)在高速 离心机上用140 00rpm离心3mi n， 弃掉上清， 得到沉于 离心管底部的DNA； (8)用500 μL 70％乙醇洗DNA沉淀 两次， 在超净工作台上干燥DNA  1h； (9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中； 将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度， 用 NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到20 0ng·L‑1。 5.根据权利 要求3所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其 特征在于， 在步骤S 3中， 所述进行BSA ‑seq分析的方法包括以下步骤： 构建花粉败育/可育性 状的对比基因池， 按照CTAB法对100个杂交后代梨叶片进行基因组DNA提取， 利用琼脂糖凝 胶电泳和Nanodrop  2000进行DNA完整性和纯度的初步检测， 合格后稀释DNA样品进行DNA浓 度的精确定量； 每 个混池中DNA等 量混合， 进行样本 重测序。 6.根据权利 要求4所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115261504 A 2特征在于， 所述进行构建花粉 败育/可育性状的对比基因池B1和B2的方法包括以下步骤： (1)样品片段化Covaris： 利用超声 波剪切DNA， 打断的DNA片段 大小集中在3 00‑500bp； (2)末端修复： 使用Covaris剪切的DNA片段形成杂合的末端， 其中包括3 ’端悬垂结构、 5’端悬垂结构和平末端； 大小不一的悬垂结构还会存在并没有磷酸化的末端； 用T4DNA聚合 酶和Klenow 酶将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端； 酶具有3'端到5'端外切核酸 酶活 性切除3'端悬垂结构并具有聚合酶活性补平5'端悬垂结构； 另外， T4  PNK将片段5 ’端磷酸 化； 最后用AMPure  XP Beads对补平反应 体系进行 纯化； (3)3'端加A反应： 在补平片段的3 ’末端连接一个A碱基减少在连接接头时片段之间的 互连， 并且由于接头的3 ’末端有一个独立T碱基， 在连接接头时， 接头与片段之间特异性连 接； (4)接头连接反应： 在DNA片段末端添加一个测序接头， 该接头与flow  cell上的扩增引 物相对应； 接头通过平末端连接在DNA片段的两端， 并且通过接头在flow  cell上进行桥式 PCR扩增， 形成测序簇； (5)纯化连接产物： 连接反应结束后用AMPure  XP Beads对补平反应体系进行纯化， 最 后用resuspensionbuffer纯化至20ul的连接产物； 用2％的琼脂糖凝胶进行电泳， 切取所要 求的片段 大小的DNA片段， 并用MI nElute Gel ExtractionKit进行回收； (6)扩增目的片段： 通过PCR反应扩增已连好两个接头DNA目的片段， PCR引 物对应着接 头的末端； 使用高保真酶和尽可能少的循环数以减少假阳性的出现； (7)纯化终产物： 用AMPure  XP Beads对PCR反应体系进行纯化； 通过琼脂糖凝胶电泳检 测PCR反应后的纯化产物， 注意 其片段大小和文库浓度； (8)上机前定量后， 进行簇生成步骤， 将序列固定 到测序用的fl owcell上。 7.根据权利 要求3所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其 特征在于， 在步骤S3中， 进行梨花粉 败育性状的S SR分子标记筛 选的方法包括以下步骤： (1)下载西洋梨和白梨基因组序列， 利用SSRIT在线分析软件对所下载序列进行SSR搜 索， 筛选SSR标记； (2)对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析。 8.根据权利 要求7所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其 特征在于， 所述SSR标记筛选标准为： 单核苷 酸、 二核苷酸、 三核苷 酸、 四核苷 酸、 五核苷酸和 六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、 9次、 6次、 5次、 4次和3次， 所有重复类型的总核 苷酸数不能少于18个； 所述SSR标记的引物设计方法， 包括： 应用Primer  5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计； 引物设计的主要参数为： 引物长 度控制在 18～24bp； 预期产物长度控制在 150～350bp； SSR位点距离序列两端大于50bp； 引 物Tm值在5 0～65℃之间， 且上、 下游引物Tm值相差小于 5℃； 引物GC(％)含量 45％～55％。 9.根据权利 要求7所述的利用BSA ‑seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法， 其 特征在于， 在步骤(2)中， 对S SR标记进行引物设计与PCR扩增分析包括： 对SSR标记进行扩增分析； SSR反应体系为15 μL， 其中包括： 模板DNA  20ng， 10×Buffer， 2.0 μmol·L‑1MgCl2， 0.2mmol·L‑1dNTPs， 正向和反向引物各0.2 μmo l·L‑1， 1.0U Taq酶； PCR扩增在