(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210759893.2 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨陵区 邰城路3 号 (72)发明人 杨增岐　王斌　白新栋　王晨骁　 魏宇辰　冯航　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 孙光远 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/15(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种三重PCR检测引物组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种三重PCR检测引物组及试 剂盒。 属于生物技术领域。 包 括： pld‑F/R、 plo‑F/ R和nuc‑F/R。 本发明分别以伪结核 棒状杆菌磷脂 酶D(pld)基因、 化脓隐秘杆菌溶血素(plo)基因 和金黄色葡萄球菌耐热核 酸酶(nuc)基因为目的 基因设计3对引物， 建立特异性强、 灵敏度高、 快 速准确的三重PCR检测方法和试剂盒。 用于羊干 酪性淋巴结炎中伪结核棒状杆菌、 化脓隐秘杆菌 和金黄色葡萄球菌的临床和实验室PCR检测， 在 羊干酪性淋巴结炎的病原快速检测、 流行病学调 查等方面具有广泛应用潜力。 能够对羊干酪性淋 巴结炎的动态监测、 流行病学调查、 实验室检测 和净化等方面提供可靠方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114959083 A 2022.08.30 CN 114959083 A 1.一种三重PCR检测引物组， 其特征在于， 包括： pld ‑F/R、 plo ‑F/R和nuc ‑F/R， 其中， pld‑F核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， pld ‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； plo ‑F核苷酸 序列如SEQ  ID No.3所示， plo ‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； nuc ‑F核苷酸序列如SEQ   ID No.5所示， nuc ‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.6所示。 2.含有权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。 3.一种非诊断治疗目的检测伪结核棒状杆菌ATCC19410的pld基因、 化脓隐秘杆菌 ATCC19411的plo基因、 金黄色葡萄球菌ATCC25923的nuc基因的方法， 其特征在于， 使用权利 要求1所述的引物。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 包括扩增体系： 2 ×Taq PCRMaster  Mix15 μL， 0.4 μmol/L上、 下游引物各0.6 μL， 模板 3 μL， 剩余由无菌DEPC水补齐至 30 μL。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 包括扩增程序： 94℃预变性5min； 94℃变性 30s， 54℃退火3 0s， 72℃延伸40s， 共3 5个循环； 72℃终延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959083 A 2一种三重PCR检测引物组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 更 具体的说是 涉及一种三重PCR检测引物组及试剂盒。 背景技术 [0002]在针对羊干酪性淋巴结炎的现有PC R检测方法 中， 从病原菌角度， 大多围绕伪结核 棒状杆菌一种细菌建立检测方法， 但国内外诸多学者及本单位研究结果表明， 羊干酪性淋 巴结炎脓肿组织中分离的细菌最多的为金黄色葡萄球菌， 其次为伪结核棒状杆菌和化脓隐 秘杆菌， 且经动物回归试验表明， 3种细菌均能引起 实验羊相似的特征性临床症状和病理变 化， 只是感染严重程度不同， 因此， 针对其中1种细菌建立检测方法不够全面。 [0003]也有关于3种细 菌的三重PC R检测方法的建立， 但与本 发明中应用的目的基因不一 致， 存在特异性 不足等问题。 [0004]因此， 如何提供一种效果更优的三重PCR引物组及检测试剂盒是本领域技术人员 亟需解决的问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了一种三重PCR检测引物组及试剂盒。 本发明选用的均为3 种细菌的特异性毒力基因， 能够 进一步提高检测方法的特异 性， 减少或消除后 期测序步骤， 节省检测周期和成本； 且本发明中建立的检测方法， 已成功制备可供直接应用的试剂盒， 具 备便捷应用能力。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种三重PCR检测引物组， 包括： pl d‑F/R、 plo‑F/R和nuc ‑F/R， 其中， pl d‑F核苷酸 序列如SEQ  ID No.1所示， pld ‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； plo ‑F核苷酸序列如SEQ   ID No.3所示， plo ‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； nuc ‑F核苷酸序列如SEQ  ID No.5所 示， nuc‑R核苷酸序列如SEQ  ID No.6所示。 [0008]本发明还提供了含有上述引物组的试剂或试剂盒。 [0009]本发明还提供了一种非诊断治疗目的检测伪结核棒状杆菌ATCC19410的pld基因、 化脓隐秘杆菌ATCC19411的plo基因、 金黄色葡萄球菌ATCC25923的nuc基因的方法， 使用上 述的引物。 [0010]有益效果： 本发明确定伪结核棒状杆菌、 化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌是当前 我国羊干酪性淋巴结炎性脓肿组织中分离率最高的3种细菌， 并均能引起羊干酪性了淋巴 结炎样病变。 [0011]针对3种细菌选定的pld、 plo、 nuc基因分别在伪结核棒状杆菌、 化脓隐秘杆菌和金 黄色葡萄球菌中携带率 为100％。 [0012]优选的： 包括扩增体系： 2 ×Taq PCR MasterMix15μL， 0.4μmol/L上、 下游引物各 0.6 μL， 模板 3 μL， 剩余由无菌DEPC水补齐至 30 μL。 [0013]优选的， 包括扩增程序： 94℃预变性5min； 94℃变性30s， 54℃退火30s， 72℃延伸说　明　书 1/5 页 3 CN 114959083 A 3