(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210759816.7 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 申请人 鲲羽生物科技 （江门） 有限公司 (72)发明人 曹罡　戴金霞　周小六　陶影峰　 (74)专利代理 机构 武汉探智知识产权代理事务 所(普通合伙) 42309 专利代理师 刘泽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种π-FISH+核酸探针组、 原位杂交方法及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一种π ‑FISH+核酸探针组、 原 位杂交方法及其应用， 所述π ‑FISH+核酸探针组 包括一级π型靶 标探针、 二级探针、 三级探针、 四 级π型探针和 信号探针。 本发明设计的π ‑FISH+ 核酸探针组克服了传统荧光原位杂交信号放大 能力低、 背景噪音大、 只能检测长核酸序列等缺 点， 具有信号放大能力强、 特异性高、 效率高、 背 景噪音低等优点； 本发明可以检测大于16个碱基 的DNA或RNA核酸分子， 可实现对长、 短核酸序列 定性、 定量和定位的检测； 另外， 本发明设计的 π‑FISH+核酸探针组可以精准地检测前列腺癌 抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7 (ARV7)， 指导患者临床治疗， 具有巨大的临床应 用潜力。 权利要求书3页 说明书14页 附图3页 CN 114959044 A 2022.08.30 CN 114959044 A 1.一种 π‑FISH+核酸探针组， 其特征在于， 包括一级π型靶标探针、 二级探针、 三级探针、 四级 π 型探针和信号探针； 其中， 所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成， 形成π型结构； 所述一级π型靶标探针包括 三个区域， 分别为 π脚区域、 π 中区域和 π顶区域， 所述 π脚区域的两个脚均 与靶标序列互补； 所述二级探针包括3 ’端和5’端序列区域以及中间序列区域， 所述3 ’端和5’端序列区域 均间隔与多个三级探针互补， 所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶 区域互补； 所述三级探针包括3 ’端和5’端序列区域以及中间序列区域， 所述3 ’端和5’端序列区域 均间隔与多个四级π型探针互补， 所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3 ’端和5’端 序列区域互补； 所述四级π型探针由左右两条探针组成， 形成π型结构， 所述四级π型探针包括三个区 域， 分别为π脚区域、 π中区域和 π顶区域， 所述三级探针3 ’端和5’端序列区域均间隔与对应 所述四级 π 型探针的两个 π脚区域互补； 所述四级 π 型探针的π顶区域与信号探针序列互补。 2.根据权利 要求1所述的π ‑FISH+核酸探针组， 其特征在于， 所述一级π型靶标探针的两 个π脚区域碱基为 16～25个， 并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基； 所述一级π型靶标探针 π中区域的两条序列碱基为6～8个， 且两条序列间有2～4个碱基互补； 所述一级π型靶标探 针 π顶区域碱基为12 ～16个。 3.根据权利要求1所述的π ‑FISH+核酸探针组， 其特征在于， 所述四级π型探针两个π脚 区域的碱基为20～22个， 并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基； 所述四级π型探针π 中区域 的两条序列的碱基为6～8个， 且两条序列间有2～4个碱基互补； 所述四级π型探针π顶区域 的碱基为9 ～20个。 4.根据权利要求1所述的π ‑FISH+核酸探针组， 其特征在于， 所述信号探针包括信号探 针A和信号探针B， 所述信号探针A的5 ’端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补， 所述 信号探针A的3 ’端部分序列与所述信号探针B的3 ’端部分序列互补； 所述信号探针A和所述 信号探针B的序列长度均为3 6～80个碱基。 5.根据权利 要求1所述的π ‑FISH+核酸探针组， 其特征在于， 所述信号探针A和所述信号 探针B序列均标记有荧光基团， 所述荧光基团选自Alexa  Fluor 488、 Alexa  Fluor 546、 Alexa Fluor 594、 Alexa  Fluor 647、 Cy3和Cy5 。 6.权利要求1～5任一项所述的π ‑FISH+核酸探针组在核酸原位检测中的应用。 7.根据权利 要求6所述的应用， 其特征在于， 所述π ‑FISH+核酸探针组可检测长、 短核酸 序列， 其中短核酸序列包括短 的DNA突变或者缺失、 可变剪切体序列、 短 的RNA序列； 所述核 酸可选自mRNA、 tRNA、 rRNA、 miRNA、 LncRNA、 ssDNA、 dsDNA、 cDNA、 和DNA序列； 所述核酸序列的 长度大于16个碱基。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述可变剪切体序列为前列腺癌 抗雄激素 治疗耐药 标志物雄激素受体剪 接变体7(ARV7)。 9.一种核酸原位检测的试剂盒， 其特征在于， 包括权利 要求1～5任一项所述的π ‑FISH+ 核酸探针组。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括预杂交液A、 预杂交 液B、 预杂交液C、 洗脱缓冲液A、 洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114959044 A 2所述预杂交液A的配制体系如下： 2.5～3mL  20×SSC， 2～3mL去离子甲酰胺， 600～800 μ L 3％SDS， 100μL  200mM氧钒核糖核苷复合物， 1～2g硫酸葡聚糖， 1mL  Denhardt's溶液， Nuclease ‑free water补充至10mL； 所述预杂交液B的配制体系如下： 2～2.5mL  20×SSC， 2～2.5mL去离子甲酰胺， 1mL  3％ SDS， 100μL  200mM氧钒核糖核苷复合物， 1～2g硫酸葡聚糖， 1mL  Denhardt's溶液， Nuclease ‑free water补充至10mL； 所述预杂交液C的配制体系如下： 2～2.5mL  20×SSC， 1～1.5mL去离子甲酰胺， 1mL  3％ SDS， 100μL  200mM氧钒核糖核苷复合物， 1～2g硫酸葡聚糖， 1mL  Denhardt's溶液， Nuclease ‑free water补充至10mL； 所述洗脱缓冲液A的配制体系如下： 1mL  20×SSC， 2mL去离子甲酰胺， 100μL  3％SDS， Nuclease ‑free water补充至10mL； 所述洗脱缓冲液B的配制体系如下： 500 μL  20×SSC， 1mL去离子甲酰胺， 100 μL  3％SDS， Nuclease ‑free water补充至10mL； 所述洗脱缓冲液C的配制体系如下： 100μL  20×SSC， 100μL  3％SDS， Nuclease ‑free  water补充至10mL。 11.权利要求9或10所述的试剂盒在核酸原位检测中的应用。 12.根据权利要求11所述的应用， 其特征在于， 所述核酸为前列腺癌 抗雄激素治疗耐药 标志物雄激素受体剪 接变体7(ARV7)。 13.一种用于检测前列腺癌循环肿瘤细胞中抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接 变体7(ARV7)的原位杂交方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 细胞固定： 将待检测的前列腺癌循环肿瘤 细胞进行固定； S2、 杂交： 首先， 分别设计第一位置探针组和第二位置探针组， 所述第一位置探针组用 于定位检测雄激素 受体剪接变体1、 2、 4和7， 所述第二位置探针组用于定位检测雄激素 受体 剪接变体5和7， 所述第一位置探针组和所述第二位置探针组均为权利要求 1～5任一项 所述 的π‑FISH+核酸探针组， 并且所述第一位置探针组和所述第二位置探针组用不同的信号探 针标记； 然后 将已处理的待检测的前列腺癌循环肿瘤细胞与所述第一位置探针组和所述第 二位置探针组在杂交液中逐步杂交； S3、 洗涤： 对杂交后的待检测的前列腺癌循环肿瘤 细胞进行洗涤； S4、 检测： 染色并拍照， 观察是否有阳性信号产生。 S5、 分析： 分析两个探针组共定位的信号。 14.根据权利要求9所述的用于检测前列腺癌循环肿瘤细胞中抗雄激素治疗耐药标志 物雄激素受体剪接变体7(ARV7)的原位杂交方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述杂交的具体 方法如下： 1)第一步杂交： 将所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中的一级π型靶标探针 与待检测的前列腺癌循环肿瘤 细胞中的核酸序列杂交； 2)第二步杂交： 将与所述第 一位置探针组和所述第 二位置探针组中分别对应的二级探 针进一步与对应的所述 一级 π 型靶探针杂交， 放大信号； 3)第三步杂交： 将与所述第 一位置探针组和所述第 二位置探针组中分别对应的三级探 针进一步与对应的所述 二级探针杂交， 进一 步放大信号；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114959044 A 3