(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210621959.1 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 大连干细胞与精准医学创新研究院 地址 116000 辽宁省大连市高新园区信达 街57号产业园4 号楼 (72)发明人 刘晶　阴晓琳　王亮　辛成齐　 (74)专利代理 机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 专利代理师 周媛媛　李馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种SLC16A2基因点突变检测引物、 检测方 法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种SLC16A2 基因点突变检测 引物、 检测方法及其应用， 属于基因工程技术领 域。 本发明设计了 六对SLC16A2基因扩增引物， 通 过提取gDNA、 SLC16A2六个外显子特异性扩增、 Sanger测序、 序列比对， 检测SLC16A2基因六个外 显子上的已知突变位点和未知突变位点， 本发明 可提前筛查成人女性遗传 AHDS(Allan ‑Herndon‑ Dudley syndrome)的风险， 为产前诊断提供新的 方法， 对于优生优育具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 CN 115011675 A 2022.09.06 CN 115011675 A 1.PCR引物在制备检测SLC16A2基因点突变的检测试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述 PCR引物的序列如SEQ  ID NO:1‑12所示。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 如SEQ  ID NO:1‑2所示的PCR引物用于扩增 SLC16A2基因序列的第1号外显子； 如SEQ  ID NO:3‑4所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因 序列的第2号外显子； 如SEQ  ID NO:5‑6所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第3号 外显子； 如SEQ  ID NO:7‑8所示的PCR引物用于扩增SLC16A2 基因序列的第4号外显子； 如SEQ   ID NO:9‑10所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第5号外显子； 如SEQ  ID NO:11‑12 所示的PCR引物用于扩增SLC16A 2基因序列的第6号外 显子。 3.一种检测SLC16A2基因点突变的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒包括权利要求1 中所述的PCR引物、 PCR扩增酶及PCR扩增缓冲液。 4.一种检测SLC16A 2基因点突变的检测方法， 其特 征在于， 主 要包括以下步骤： (1)从外周血中提取DNA， 得到gDNA， 并对其浓度和纯度进行测定； (2)将步骤(1)得到的gDNA与权利要求1中所述的PCR引物和PCR扩增试剂混合， 经过PCR 反应， 扩增SLC16A 2 DNA片段， 并进行 纯度和浓度测定； (3)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)得到的SLC16A 2 DNA片段的质量； (4)通过Sanger测序法检测步骤(2)得到的SLC16A2  DNA片段， 获得样本SLC16A2基 因序 列； (5)将步骤(4)获得的样本SLC16A2基因序列与野生型SLC16A2基因序列比对， 获得突变 位点。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1 )中提取DNA过程采用QIAamp   DNA Mini Kit提取试剂盒提取； 利用紫外分光 光度计测量gDNA的浓度和纯度。 6.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中的PCR反应体系中正向引物 和反向引物的摩尔浓度均为10 0～1000nM， gDNA的浓度为5 0～100 μg/mL。 7.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中PCR扩增第1、 2、 3、 4和5号外 显子时， 扩增程序为： 96～100℃变性5～20秒， 58～62℃退火5～10秒， 70～74℃延伸10～20 秒， 循环3 0～50次， 0～4℃保存。 8.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中PCR扩增第6号外显子时， 扩 增程序为： 96～100℃变性5～20秒， 53～57℃退火5～10秒， 70～74℃延伸15～30秒， 循环30 ～50次， 0～4℃保存。 9.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳所用的琼 脂糖凝胶的浓度为1～ 2％； 电泳的电压为10 0～150V， 时间为20～3 0分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011675 A 2一种SLC16A2基因点突变检测引物、 检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体地说， 涉及一种SLC16A2基因点突变检测引 物、 检测方法及其应用。 背景技术 [0002]AHDS(Allan‑Herndon‑Dudley syndrome)是罕见的X连锁隐性遗传病， 属于遗传性 痉挛性截瘫中甲状腺功能缺陷的一个亚型。 临床表现复杂， 主要表现为锥体束征(剪刀布 态)、 肌张力减退、 肌肉萎缩等运动发育迟滞以及智商<30、 冷漠、 基本交际能力和语言永久 缺失、 饮食二便无法自理等智 力发育迟缓， 给家 庭和社会带来了沉重负担 。 [0003]AHDS(Allan ‑Herndon‑Dudley syndrome)是以X连锁方式遗传， 由SLC16A2基因突 变导致(其中点突变比例为85％， 拷贝数突变比例为15％)。 SLC16A2基因编码一种完整的膜 蛋白： 单羧酸转运蛋白8(Monocarboxylate  transporter  8， MCT8)， 负责转运甲状腺激素。 MCT8有助于细胞摄取四碘甲状腺原氨酸(T4)、 三碘甲状腺原氨酸(T3)、 反向三碘甲状腺原 氨酸(rT3)和二碘甲状腺原氨酸(T2)。 而SLC16A2基因在许多组织中表达， 并且在中枢神经 系统的发育中起重要作用。 因此， 男性SLC16A2基因突变会导致中枢性甲状腺功能减退症， 并且存在严重的神经系统异常， 包括整体发育迟缓， 中枢性肌张力低下， 痉挛性四肢瘫痪， 肌张力障碍运动， 眼球震颤以及视线和听力受损； 在其他组织(肌肉， 心脏， 皮肤， 骨骼， 肠) 中， 临床表现为甲状 腺激素利用率降低， 并伴有外周甲状腺功能减退。 另外， SLC16A2 突变杂 合子女性的甲状腺相关表型较轻， 没有神经系统缺陷。 SLC16A2 突变杂合子女性虽然没有明 显的临床表现， 但是其长大成人一旦怀孕后， 若腹中胎儿是男孩则百分之百患病， 将会给家 庭及社会 带来沉重负 担。 因此， 进 行备孕期女性SLC16A2基因筛查可为产前诊断增加一种新 的方法， 对于优生优育具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明旨在提供一种S LC16A2基因点突变检测的引物、 检测方法及其应用， 以解决 上述背景技术中的问题。 通过设计特异性扩增引物， 进 行聚合酶链式反应(PCR)， 对P CR扩增 产物进行Sanger测序得到样 本的gDNA序列信息， 与野生基因型比对， 找出SLC16A2基因突变 位点， 该方法能够检测SLC16A 2基因第1、 2、 3、 4、 5和6号外 显子中已知和未知的突变。 [0005]本发明采用如下技 术方案： [0006]本发明提供PCR引物在制备检测SLC 16A2基因点突变的检测试剂盒中的应用， 所述 PCR引物的序列如SEQ  ID NO:1‑12所示。 [0007]进一步地， 如SEQ  ID NO:1‑2所示的P CR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第1号外 显子； 如SEQ  ID NO:3‑4所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第2号外显子； 如SEQ   ID NO:5‑6所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第3号外显子； 如SEQ  ID NO:7‑8所 示的PCR引物用于扩增SLC16A2 基因序列的第4号外显子； 如SEQ  ID NO:9‑10所示的PCR引物 用于扩增SLC16A2基因序列的第5号外显子； 如SEQ  ID NO:11‑12所示的PCR引物用于扩增说　明　书 1/4 页 3 CN 115011675 A 3