(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210695244.0 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 成都博迈达科技有限公司 地址 610000 四川省成 都市高新区吉庆四 路188号1栋1单 元6层605号 (72)发明人 樊军　王佳佳　 (74)专利代理 机构 成都佳划信知识产权代理有 限公司 5126 6 专利代理师 楚鸿艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/54(2006.01)C12N 9/14(2006.01) C12N 9/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种RNA载体相关移位复合物的制备方法及 其应用 (57)摘要 本申请涉及生物标志物 技术领域， 尤其涉及 一种RNA载体相关移位复合物的制备方法及其应 用； 所述移位复合物包括RNA载体， 所述RNA载体 包括RNA载体核心序列、 生物素标记引物和地高 辛标记引物， RNA载体核心序列的正向序列如SEQ   ID NO.1所示， RNA载体核心序列的反向序列如 SEQ ID NO.2所示； 通过包括RNA载体核心序列、 生物素标记引物和地高辛标记引物的RNA载体， 将RNA载体的一端通过生物素标记引物连接链霉 素包裹的磁珠， 另一端 连接在抗地高辛处理的玻 璃表面， 结合牢固。 RNA载体核心区域可以同 Holo‑RdRp聚合全酶、 n sp13解旋酶组成移位复合 物， 利用单分子磁镊 技术‑实时有效的反映nsp13 反应的动力学 特征。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图7页 CN 115029415 A 2022.09.09 CN 115029415 A 1.一种RNA载体， 其特征在于， 所述RNA载体包括RNA载体核心序列、 生物素标记引物和 地高辛标记引物， 所述生物素标记引物设于所述 RNA载体核心序列的5 ’端， 所述地高辛标记 引物设于所述RNA载体核心序列的3 ’端， 所述RNA载体核心序列包括正 向序列p‑RNA和反向 序列t‑RNA， 所述正向序列p ‑RNA的序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述反向序列t ‑RNA的序列如 SEQ ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的RNA载体， 其特征在于， 所述RNA载体还包括TRS序列， 所所述 TRS序列设于所述RNA载体核心序列的5 ’端， 所述生物素标记引物设于所述TRS序列的5 ’端。 3.一种转录延伸复合物， 其特征在于， 所述转录延伸复合物包括Holo ‑RdRp聚合全酶以 及权利要求1或2所述的RNA载体， 所述Holo ‑RdRp聚合全酶的亚基包括nsp12亚基、 nsp7亚基 和nsp8亚基。 4.一种RNA载体相 关移位复合物， 其特征在于， 所述移位复合物包括nsp13解旋酶及权 利要求3所述的转录延伸复合物。 5.一种RNA载体相关移位复合物的制备 方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 构建权利要求1或2所述的RNA载体； 对权利要求3所述的nsp12亚基的基因片段和权利要求4所述的nsp13解旋酶的基因片 段进行探针标记， 得到荧光探针标记的nsp12 亚基基因片段和荧光探针标记的nsp13解旋酶 基因片段； 对荧光探针标记的所述nsp12亚基基因片段进行质粒转化， 后进行表达和纯化， 得到含 有荧光探针标记的nsp12亚基蛋白； 对含有荧光探针标记的所述nsp12亚基蛋白进行生物素标记， 得到含有生物素标记换 和荧光探针标记的双重标记nsp12亚基蛋白； 分别纯化权利要求3所述的nsp 7亚基和nsp8亚基， 后加入双重标记nsp12亚基蛋白进行 混合， 得到含纯化的nsp7亚基蛋白、 纯化的nsp8亚基蛋白和双重标记的nsp12亚基蛋白的 Holo‑RdRp聚合全酶； 对所述RNA载体和所述Ho lo‑RdRp聚合全酶进行第一孵 育反应， 得到转录延伸复合物； 对荧光探针标记的nsp13解旋酶基因片段进行质粒转化， 后进行表达和纯化， 得到纯化 的nsp13解旋酶蛋白； 对所述转录延伸复合物和纯化的所述nsp13解旋酶蛋白以预设体积进行混合， 后加入 ADP‑AlF3进行第二孵 育反应， 得到移位复合物。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述对荧光探针标记的所述nsp12亚基基 因片段进行质粒转化， 后进行表达和纯化， 得到含有荧光探针标记的nsp12亚基蛋白， 具体 包括： 融合含有荧光探针标记的nsp12亚基基因片段的pRS FDuet‑1质粒和avi ‑tag质粒， 得到 复合质粒； 转化所述复合质粒至大肠杆菌的感受态细胞中， 后进行IPTG诱导和裂解， 得到裂解产 物； 收集所述裂解产物， 后以纯化柱进行筛选过滤， 得到纯化的荧光探针标记的nsp12亚基 蛋白。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述对含有荧光探针标记的所述nsp12亚权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029415 A 2基蛋白进行生物素标记， 得到含有生物素标记换和荧光探针标记的双重标记nsp12亚基蛋 白， 具体包括： 对纯化的所述荧光探针标记的nsp12亚基蛋白和生物素以连接酶进行第三孵育反应， 得到双重标记的nsp12亚基蛋白。 8.根据权利 要求5所述的方法， 其特征在于， 所述nsp7亚基或所述nsp8亚基的纯化方法 包括： 转化含有nsp7亚基基因片段或nsp8亚基基因片段的pCDFduet质粒至大肠杆菌的感受 态细胞中， 后进行IPTG诱 导和裂解， 得到裂解产物； 收集所述裂解产物， 后以纯化柱进行筛选过滤， 得到纯化的nsp7亚基蛋白或纯化的 nsp8亚基蛋白。 9.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述对荧光探针标记的nsp13解旋酶基因 片段进行质粒转 化， 后进行表达和纯化， 得到纯化的nsp13解旋酶蛋白， 具体包括： 转化含有荧光探针标记的nsp13亚基基因片段的pet28质粒至大肠杆菌的感受态细胞 中， 后进行IPTG诱 导和裂解， 得到裂解产物； 收集所述裂解产物， 后以纯化柱进行筛 选过滤， 得到纯化的nsp13亚基蛋白。 10.一种RNA载体相关移位复合物 的应用， 其特征在于， 所述应用包括： 将权利要求5所 述的移位复合物用于对nsp13反应的动力学 特征研究的单分子磁镊技 术中。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029415 A 3