(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607540.0 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 陕西脉元生物科技有限公司 地址 710311 陕西省西安市高新区草堂科 技产业基地秦岭大道西2号科技企业 加速器园区1期八号楼1- 3-2.1-2-2 (72)发明人 李科　赵子越　闫亚平　程静美　 郝文斌　封雪　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C07K 14/705(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01)C12N 15/85(2006.01) C12Q 1/6883(2018.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 25/08(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (54)发明名称 一种NMDAR NR1亚基、 NMDAR的突变体及其构 建方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种NMDARNR1亚基、 NMDAR的 突变体及其构建方法和应用， 涉及生物医药技术 领域。 本发明所述NMDARNR1亚基突变体不识别抗 NMDAR脑炎患者中的自身 抗体， 但当其与NMDAR的 NR2亚基共转时， 表现出了与野生型NR1相同的钙 内流功能， 从而为NMDAR相关疾病在基因水平上 的诊断治疗提供了重要的方向， 包括用于替换障 碍型NMDAR离子通道、 治疗致病性抗体导致的突 出后膜表面NMDAR减少导致的疾病等相关性疾 病。 权利要求书1页 说明书8页 序列表9页 附图2页 CN 114957445 A 2022.08.30 CN 114957445 A 1.一种NMDA RNR1亚基的突变体， 其特征在于， 所述突变体不识别抗NMDAR脑炎患者的自 身抗体； 所述突变体包括缺失NMDARNR 1亚基编码氨基酸序列的837 ‑838位和864 ‑937位。 2.根据权利要求1所述突变体， 其特征在于， 所述NMDARNR1亚基的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 3.一种构建权利要求1或2所述突变体的引物对， 其特征在于， 包括837 ‑838‑F、 837‑ 838‑R、 864‑937‑F和864‑937‑R， 所述837 ‑838‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 所述 837‑838‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述864 ‑937‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6 所示， 所述864 ‑937‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示。 4.一种构建权利要求1或2所述突变体的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)以SEQ   ID NO.1所示的核苷酸序列为模板， 利用864 ‑937‑F和864‑937‑R进行PCR扩增， 得缺失864 ‑ 937位氨基酸的NRI亚基突变体； 所述864 ‑937‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述 864‑937‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； (2)以所述缺失864 ‑937位氨基酸的NRI亚基突变体为模板， 利用837 ‑838‑F和837‑838‑ R进行PCR扩增， 得缺失837～838位和864 ‑937位氨基酸的NMDAR  NR1亚基的突变体； 所述 837‑838‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 所述83 7‑838‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5 所示。 5.根据权利要求4所述方法， 其特征在于， 步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的体系均以 50 μL计， 包括： 模板50n g、 引物F 2 μL、 引物 R 2 μL、 Fast  Pfu DNA Polymerase  1μL、 5×Fast  Pfu buffer 10 μL、 2.5mM  dNTP 4 μL、 DMSO 1 μL和余量的无核酸酶水； 步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的程序， 均包括： 98℃预变性2min； 98℃变性15s， 59℃ 退火15s， 72℃延伸4mi n， 33个循环； 72℃再延伸8mi n。 6.一种构建NMDAR突变 体的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将权利要求1或2所述 突变体插入真核表达载体上， 得NR 1重组载体； (2)将NMDAR的NR2亚基插 入真核表达载体上， 得NR2重组载体； (3)将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞， 得NMDAR突变 体； 步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后顺序。 7.根据权利要求6所述方法， 其特 征在于， 步骤(1)和步骤(2)所述真核表达载体相同。 8.根据权利要求6所述方法， 其特征在于， 步骤(2)所述NR2亚基包括NR2a或NR2b， 所述 NR2a的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述 NR2b的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 9.根据权利要求6所述方法， 其特征在于， 步骤(3)所述共同转染时， 所述NR1重组载体 和NR2重组载体的质量比为(1:1)～(1:4)。 10.权利要求1或2所述突变体或利用权利要求6～9任一项所述方法制备得到的NMDAR 突变体在制备NMDAR相关疾病的诊断和/或治疗的试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114957445 A 2一种NMDAR  NR1亚基、 NMDAR的突变体及其构建 方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种NMDAR  NR1亚基、 NMDAR的突变体及 其构建方法和应用。 背景技术 [0002]NMDAR是一种 分布在神经细胞突触后膜表面的离子通道蛋白， 是离子型谷氨酸受 体的亚型之一， 由NR1、 NR2和NR3亚单位构成。 在有功能活性的NMDAR中， 其4个亚基至少应有 1个NR1及 1个NR2， 而绝大多数的NMDAR由2个NR1及2个NR2组成， 也有少部分由3种亚基共同 组成。 NMDA受体有复杂的分子结构和独特的药理学特性， 它对钙 离子具有高通透性， 这使得 NMDA受体在突触可塑性及兴奋毒性方面具有重要作用。 当神经递质与NMDAR结合后， 功能性 NMDAR离子通道打开， C a2+内流， 继而触发一系列的生化反应， 可促进学习和记忆的功能； 但 过量的Ca2+内流会导致神经元坏死， 引起 学习记忆障碍。 人类各种神经退行性和神经精神疾 病的发病机制和病理生理过程可能与NMDAR通道故 障相关， 因此， 对NMDAR通道的研 究可为 治疗性药物的开发提供靶点。 [0003]抗NMDAR脑炎是最主要的一种自身免疫性脑炎， 占自身免疫性脑炎患者 的70％～ 80％。 NMDAR脑炎患者中主要存在的是针对NMDAR的NR1亚基的特异性IgG抗体。 这些抗体具 有致病性， 可诱导NMDA受体的交联和内化， 并阻断NMDAR依赖的突触电活动， 引起癫痫、 精神 行为异常和意识障碍等临床表现。 有研 究表明， 抗NMDAR脑炎患者的抗体会抑制NMDAR依赖 性的细胞内Ca2+流入(Ignacio  R A,Josep D,Teresa  S,et al.Isolated  hemidystonia   associated  with NMDA receptor  antibodies[J].Movement  disorders:official   journal of the Movement  Disorder  Society,2011,26(2):351)。 因此， 维持NMDAR依 赖性 的细胞内Ca2+流入， 对Ca2+介导的生理生 化反应极为重要。 [0004]另有研究表明， 在激活NMDAR通道而不是其他Ca2+通道(包括红藻氨酸受体和电压 敏感Ca2+通道)后， 钙很容易进入线粒体。 Ca2+向线粒体转运 的抑制保护神经元免受谷氨酸 (Glu)介导的细胞死亡。 Fu kumori等人通过人胚胎肾(HEK) ‑293细胞制备获得性NMDAR通道， 证明线粒体解偶联蛋白 ‑2(UCP2)可能在一定程度上参与了细胞功能和 /或功能障碍， 其机 制与激活功能性NMDAR通道后调节线粒体游离Ca2+水平有关(Fukumori  R,Takarada  T, Kambe Y,et al.Possible  involvement  of mitochondrial  uncoupling  protein‑2in  cytotoxicity  mediated  by acquired  N‑methyl‑D‑aspartate  receptor  channels[J] .Neurochemistry  international,2012,61(4):498 ‑505)。 因此， NMDAR通道钙内流功能的 研究对NMDAR相关疾病的诊断治疗具有重要的意 义。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种NMDAR  NR1亚基、 NMDAR的突变体及其构建 方法和应用， 所述NMDAR  NR1亚基突变体不识别抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体， 但当其与 NMDAR的NR2亚基共转时， 表现出了与野生型NR1相同的钙内流功能， 从而为NMDAR相关