(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211184218.8 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 苏州康唯纳思生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区东旺 路8号七号楼 A幢5楼 (72)发明人 黄学文　唐磊　 (74)专利代理 机构 苏州智远 浅行知识产权代理 事务所(普通 合伙) 32693 专利代理师 唐婷婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01)C12R 1/01(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种MP、 Cpn和HRV核 酸检测的试剂盒及使用 方法 (57)摘要 本发明公开了一种MP、 Cpn和HRV核 酸检测的 试剂盒及使用方法， 属于生物技术领域。 检测试 剂盒中的引物和探针组合包括分别用于肺炎支 原体ATPase基因(DNA)、 肺炎衣原体OmpA基因 (DNA)和人鼻病毒5 ’UTR核酸(RNA)检测的引物 探 针组合， 还包括以人A ctin基因(DNA)为内标的引 物探针组合。 本发明的引物探针序列高度保守， 针对各自基因的高度特异区进行设计， 各组引物 探针之间无明显干扰； 包含了上述引物和探针组 合的检测试剂盒可用于肺炎支原体DNA、 肺炎衣 原体DNA和人鼻病毒RNA的同时检测， 检测灵敏度 高、 特异性强， 提高了呼吸道感染性疾病的病原 学检测效率。 权利要求书2页 说明书10页 附图6页 CN 115466801 A 2022.12.13 CN 115466801 A 1.一种MP、 Cpn和HRV核酸检测的试剂盒， 用于肺炎支原体ATPase基因DNA、 肺炎衣原体 OmpA基因DNA和人鼻病毒5 ’UTR RNA的同时检测， 其特征在于： 包括如下引物和探针的组合， 所述引物和探针组合的序列为： 2.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中还包括用于内标的人Actin 基因检测的引物和探针， 且 所述用于内标的人Act in基因检测的引物的探针的序列分别为： 人Actin基因上游引物序列： 5 ’ ‑GATCCCAGAGGTGCATTA‑3’； 人Actin基因下游引物序列： 5 ’ ‑AGTCCTCCAGATCCTTTG‑3’； 人Actin基因探针序列： 5 ’ ‑Cy5‑CAAGCCAGTTACCATGAGGAATCC‑3’。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中还包括PCR增强剂， 所述PCR 增强剂包括硫酸铵、 β ‑环糊精、 Twe en20和BSA中的一种或多种的混合物。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于： 所述检测试剂盒中还包括防污染酶混合 液， 所述防污染酶混合液包括dUTP、 UNG酶、 Hotstar  DNA聚合酶、 逆转录酶和RNA酶抑制剂中 的一种或多种的混合物。 5.如权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于： 所述检测试剂 盒中还包括阳性对照和阴性 对照， 所述阳性对照包括含有肺炎支原体ATPase基因片段的载体、 含有肺炎衣原体OmpA基 因片段的载体、 含有人鼻病毒5 ’UTR核酸片段的病毒样 颗粒、 以及TE  Buffer； 所述阴性对照 为氯化钠溶 液。 6.一种如权利要求5所述的试剂盒的使用方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)核酸提取： 对样本进行核酸 提取； (2)预处理： 取出检测试剂盒内的试剂， 进行离心处 理； (3)配制PCR反应 体系： 配制PCR反应 体系并分配至PCR反应管中； (4)加样： 向配制完成的PCR反应体系中分别加入提取的样本核酸、 阳性对照和阴性对 照； (5)扩增检测： 将PCR反应管放置在荧 光定量PCR仪中进行扩增检测； (6)结果判断： 对检测样本进行 阴阳性判断。 7.如权利要求6所述的使用方法， 其特征在于： 步骤(5)中的扩增检测步骤依次包括逆 转录， 预变性， 变性， 以及退火、 延伸和荧光采集； 其中逆转录在50℃下进行， 预变性在97℃权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466801 A 2下进行， 变性在97℃下进行， 退火、 延伸和荧 光采集在58℃下进行。 8.如权利要求6所述的使用方法， 其特征在于： 步骤(6)中的结果判断需同时满足以下 条件： 所述阴性对照反应管中， FAM、 VIC、 ROX和Cy5通道均无Ct值或Ct值＞40； 所述阳性对照反应管中， FAM、 VIC和ROX通道Ct值均≦3 0， 扩增曲线呈典型 “S”形； 若不满足上述条件， 则本次实验无效， 重新实验。 9.如权利要求8所述的使用方法， 其特 征在于： 步骤(6)中的结果判断方法为： 样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM、 VIC和ROX通道未 检测到扩增曲线或Ct值＞40的样本， 报告为MP、 Cpn和HRV阴性； 样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM通道检测到典型 的S型扩增曲线且Ct≦3 6的样本， 报告为MP阳性； 样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， VIC通道检测到典型 的S型扩增曲线且Ct≦3 6的样本， 报告为Cpn阳性； 样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， ROX通道检测到典型 的S型扩增曲线且Ct≦3 6的样本， 报告为HRV阳性； 样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM、 VIC或ROX通道检 测到扩增曲线且3 6＜Ct＜40的样本， 考虑为相应病原体可疑阳性， 样本需复测后报告； 样本反应管中， Cy5通道未扩增出典型 “S”形曲线， 无论FAM、 VIC或ROX通道是否检测到 典型的S型扩增曲线， 本次实验均视为无效， 应查找并排除原因， 并重新实验。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466801 A 3