(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210759220.7 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 中国科学院苏州生物医学工程 技术 研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科灵路 88号 (72)发明人 尹焕才　陈名利　殷建　茹静　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 周淑歌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种LAMP试剂及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种LAMP试剂及其应用， 属于分 子生物学技术领域。 本发明提供了一种LAMP试 剂， 包括Tris ‑HCl、 (NH4)2SO4、 KCl、 表面活性剂、 MgSO4、 甜菜碱、 MnCl2、 牛血清白蛋白、 DNA聚合 酶、 逆转录酶、 二甲基亚砜、 聚乙二醇和指示剂， 其中， (NH4)2SO4可增强反应 特异性， KCl能够促进 引物的吸附， 表面活性剂和聚乙二醇能够减少错 配， 提高扩增特异性， 去除二级结构提高扩增 效 率， MgSO4和MnCl2作为聚合酶活性的辅助因子， 有助于聚合期间dNTP的结合， 甜菜碱能够保持酶 的活性， 有利于打开双链， 提高扩增效率， 牛血清 白蛋白能够保持酶活性， 二甲基亚砜 可辅助打开 双链结构， 提高扩增效率。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114875122 A 2022.08.09 CN 114875122 A 1.一种LAMP试剂， 其特征在于， 所述LAMP试剂包括Tris ‑HCl、 (NH4)2SO4、 KCl、 表面活性 剂、 MgSO4、 甜菜碱、 MnCl2、 牛血清白蛋白、 DNA聚合酶、 逆转录酶、 二甲基亚砜、 聚乙二醇和 指 示剂； 所述指示剂包括 荧光指示剂或显色指示剂中的至少一种。 2.如权利要求1所述的LAMP试剂， 其特征在于， 所述表面活性剂包括Tween  20、 Triton、 甜菜碱或聚乙二醇中的至少一种。 3.如权利要求1或2所述的LAMP试剂， 其特征在于， 所述荧光指示剂包括syto  9、 syto11、 syto 12、 syto 14或syto  16中的至少一种。 4.如权利 要求1～3任一项所述的LAMP试剂， 其特征在于， 所述显色指示剂包括酚红、 钙 黄绿素、 羟基萘酚蓝或SYBR  Green I中的至少一种。 5.如权利要求1～4任一项所述的LAMP试剂， 其特征在于， 所述Tris ‑HCl在LAMP试剂中 的浓度为10～40mM； 所述(NH4)2SO4在LAMP试剂中的浓度为5～20mM； 所述KCl在LAMP试剂中 的浓度为10～100mM； 所述表面活性剂在LAMP试剂中的质量百分比浓度为0.05～1％； 所述 MgSO4在LAMP试剂中的浓度为2～20mM； 所述甜菜碱在LAMP试剂中的浓度为0.1～10mM； 所述 MnCl2在LAMP试剂中的浓度为0.1～1mM； 所述牛血清白蛋白在LAMP试剂中的浓度为0.2～ 2mg/mL； 所述DNA聚合酶在LAMP试剂中的浓度为4～12U； 所述逆转录酶在LAMP试剂中的浓度 为2～10U； 所述二甲基亚砜在LAMP试剂中的质量百分比浓度为1～10％； 所述聚乙二醇在 LAMP试剂中的质量百分比浓度为1～10％； 所述荧光指示剂在LAMP试剂中的浓度为0.1～10 μM； 所述显色指示剂在LAMP试剂中的浓度为0.1～ 2mM。 6.一种用于核酸检测的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述LAMP检测试剂盒包括权利 要求1～5任一项所述的LAMP试剂和靶向靶标核酸的LAMP引物组。 7.一种核酸检测方法， 其特征在于， 所述方法为： 使用权利要求6所述的LAMP检测试剂 盒对待测样本进行检测， 将权利要求1～5任一项所述的LAMP试剂、 靶向靶标核酸的LAMP引 物组和待测样 本混合， 得到LAMP反应体系； 将LAMP反应体系进 行孵育， 孵育过程中检测孵育 液的荧光值， 若孵育液的荧光值较孵育前有变化且变化幅度超过20％， 则待测样本中有靶 标核酸； 或者， 所述方法为： 使用权利要求6所述的LAMP检测试剂盒对待测样本进行检测， 将权 利要求1～5任一项所述的LAMP试剂、 靶向靶标核酸的LAMP引物组和待测样本混合， 得到 LAMP反应体系； 将LAMP反应体系进行孵育， 孵育结束后， 观察孵育液是否变色， 若孵育液变 色， 则待测样本中有靶标核酸。 8.如权利要求7所述的核酸检测方法， 其特征在于， 所述孵育的温度为60～65℃、 时间 为30～60min。 9.如权利要求7或8所述的核酸检测方法， 其特征在于， 所述靶标核酸为甲型流感病毒 的L基因； 所述L基因的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述靶向靶 标核酸的LAMP引物组包 括核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的上游内部引物FIP、 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的 上游外部引物F3、 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的下游内部引物BIP、 核苷酸序列如SEQ   ID NO.5所示的下游外部引物B3、 核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示的环状引物Loop  F和核苷 酸序列如SEQ  ID NO.7所示的环状引物L oop B。 10.权利要求1～5任一项所述的LAMP试剂或权利要求6所述的LAMP检测试剂盒或权利 要求7～9任一项所述的核酸检测方法在核酸检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875122 A 2一种LAMP试剂及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种LAMP试剂及其应用， 属于分子生物学技 术领域。 背景技术 [0002]等温核酸扩增技术是一种能在体外恒温条件下高效、 快速且经济地扩增核酸的检 测技术。 该技术方法能够在60～65℃恒温条件 下实现核酸靶标分子的高特异 性和高灵敏度 扩增。 与其他的核酸扩增技术相比， 该技术方法具有快速、 高效、 特异性强、 结果易判断、 无 需特殊仪器且不依赖变温的优点。 [0003]目前， 常见的等温核酸扩增技术包括LAMP(Loop ‑mediated  isothermal   amplification,环介导等温扩增技术)、 RPA(Reco mbinase Polymerase Amplification,重 组酶聚合酶扩增技术)、 RCA(Rolling  circle amplification,滚环复制扩增技术)、 CPA (Crossing  Priming Isothermal  Amplification,交叉引物等温扩增技术)、 SDA(Strand   displacement  amplification,链置换扩增技术)和HDA(Helicase  dependent   amplification,解旋酶依赖性扩增技术)。 这些技术均在开发便携式基因诊断工具方面具 有很大的潜力， 并且， 这些技术均将极大 的促进和改善很多疾病的快速诊断技术和现场筛 查现状。 [0004]然而， 现阶段， 等温核酸扩增技术在检测稳定性、 灵敏度、 特异性和抗干扰度方面 仍存在很多缺陷， 这些缺陷导致恒温扩增技术大多都局限于实验室内的基因筛查， 少有用 于实际临床检测。 因此， 亟需找到提高等温核酸扩增技术检测稳定性、 灵敏度、 特异性和抗 干扰度的方法， 以推动等温核酸扩增技 术在临床上的应用。 发明内容 [0005]为解决上述问题， 本发明提供了一种LAMP试剂， 所述LAMP试剂包括Tris ‑HCl、 (NH4)2SO4、 KCl、 表面活性剂、 MgSO4、 甜菜碱、 MnCl2、 牛血清白蛋白、 DNA聚合酶、 逆转录酶、 二 甲基亚砜、 聚乙二醇和指示剂； 所述指示剂包括 荧光指示剂或显色指示剂中的至少一种。 [0006]在本发明的一种实施 方式中， 所述表面活性剂包括Tween  20、 Triton、 甜菜碱 或聚 乙二醇中的至少一种。 [0007]在本发明的一种实施方式中， 所述荧光指示剂包括syt o 9、 syto11、 syto  12、 syto  14或syto  16中的至少一种。 [0008]在本发明的一种实施方式中， 所述显色指示剂包括酚 红、 钙黄绿素、 羟基萘酚蓝或 SYBR Green I中的至少一种。 [0009]在本发明的一种实施方式中， 所述Tris ‑HCl在LAMP试剂中的浓度为10～40mM； 所 述(NH4)2SO4在LAMP试剂中的浓度为5～20mM； 所述KCl在LA MP试剂中的浓度为10～100mM； 所 述表面活性剂在LAMP试剂中的质量百分比浓度为0.05～1％； 所述MgSO4在LAMP试剂中的浓 度为2～20mM； 所述甜菜碱在LAMP试剂中的浓度为0.1～10mM； 所述MnCl2在LAMP试剂中的浓 度为0.1～1mM； 所述牛血清白蛋白在LAMP试剂中的浓度为0.2～2mg/mL； 所述DNA聚合酶在说　明　书 1/6 页 3 CN 114875122 A 3