(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646129.4 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 河北三狮生物科技有限公司 地址 050000 河北省石家庄市高新区黄河 大道136号石家庄科技中心 2号楼2215 (72)发明人 董振国　时国强　刘昱　焦义然　 石磊　 (74)专利代理 机构 河北国维致远知识产权代理 有限公司 13137 专利代理师 任青 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原 体的引物和 探针及其应用 (57)摘要 本发明涉及动物疫病检测技术领域， 具体公 开一种LA MP‑Taqman检测鸡毒支原体的引物和探 针及其应用。 检测鸡毒支原体的引物和探针中， 内引物FIP的序列如SEQ  ID NO:1， 内引物BIP的 序列如SEQ  ID NO:2， 外引物F3的序列如SEQ  ID  NO:3， 外引物B3的序列如SEQ  ID NO:4， 环引物LF 的序列如SEQ  ID NO:5， 环引物 探针的序列如SEQ   ID NO:6。 利用本发明的引物和探针， 可 实现对鸡 毒支原体的准确检测， 且 方法可避免非特异性扩 增导致的假阳性结果的出现， 特异性强、 灵敏度 高、 最低检测限可达0.2 58fg/μL， 对鸡毒支原 体 的早期临床检测提供了可靠保障。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 114959081 A 2022.08.30 CN 114959081 A 1.一种LAMP ‑Taqman检测鸡毒支 原体的引物和探针， 其特 征在于， 包括： 内引物FIP： 5 ′ ‑CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA‑3′； 内引物BIP： 5 ′ ‑GGAATGGATAATGCTGCTC CACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT‑3′； 外引物F3： 5 ′ ‑CTGAACCAAAGCCAAATCC‑3′； 外引物B3： 5 ′ ‑GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT ‑3′； 环引物LF： 5 ′ ‑GGAGGGTTTGGCATCGGATC‑3′； 环引物探针LBP： 5 ′ ‑AGCAGCTGCTA AAACAGCTTTGA‑3′。 2.如权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述环引物探针LBP的5 ′端标记有荧 光基团， 3 ′端标记有淬灭基团。 3.如权利要求2所述的引物和探针， 其特征在于， 所述环引物探针LBP为： 5 ′ ‑FAM‑ AGCAGCTGCTA AAACAGCTTTGA‑3′BHQ。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针在非诊断性检测鸡毒支 原体中的应用。 5.一种用于检测鸡毒支原体的试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1 ‑3任一项所述的引 物和探针。 6.如权利要求5所述的用于检测鸡毒支原体的试剂盒， 其特征在于， 还包括基础缓冲 液、 氯化钾溶 液、 硫酸铵溶 液、 吐温20、 DNA聚合酶、 甜菜碱、 硫酸镁溶 液、 dTNPs和去离 子水。 7.利用权利要求5所述的试剂盒检测鸡毒支原体的方法， 其特征在于， 具体操作为： 提 取鸡毒支原体的核酸为模板， 用所述试剂盒进行LAMP扩增， 并在扩增过程中进行实时荧光 检测。 8.如权利要求7所述的检测鸡毒支原体的方法， 其特征在于： 所述LAMP扩增的体系包括 以下试剂及用量： pH8.8Tris ‑HCl 20mmol， KCl  10mmol， (NH4)2SO4 10mmol， 吐温20  0.024 μ L， Bst DNA polymerase  large fragment  8U， Taq DNA polymerase  5U， 甜菜碱1mol， MgSO4  8mmol， dNTPs  1.6mmol， 内引物FIP  2.0 μmol， 内引物BIP  2.0 μmol， 外引物F3  0.5 μmol， 外引 物B3 0.5 μmol， 环引物LF  0.5 μmol， 环引物探针LBP  0.5 μmol， 去离子水补足至24 μL。 9.如权利要求7所述的检测鸡毒支原体的方法， 其特征在于： 所述LAMP扩增的反应温度 为62℃‑64℃， 反应时间为 45‑50min。 10.如权利要求9所述的检测鸡毒支原体的方法， 其特征在于： 所述LAMP扩增的反应温 度为63℃， 反应时间为 45min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959081 A 2一种LAMP ‑Taqman检测鸡毒 支原体的引物和探针及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及动物疫病检测技术领域， 尤其涉及一种LAMP ‑Taqman检测鸡毒支原体 的引物和探针及其应用。 背景技术 [0002]鸡毒支原体(Mycoplasma  galliscepticum， MG)是一种引起鸡呼吸道感染疾病的 支原体， 不同菌株的感染性和致病性不同， 感染后的主要临床表现为流鼻涕、 流眼泪、 咳嗽， 严重时表现为呼吸困难或张口呼吸， 可听到湿性啰音。 而且鸡感染后一般是隐性带菌， 因 此， 早期筛查是防治的关键。 目前， 常用的检测鸡毒支原体的方法包括酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent  assay， ELISA)， 聚合酶链反应(Polymerase  chain  reaction， PCR)和实时荧光定量qPCR等， 但是， 上述检测方法均需要复杂的操作程度和昂贵 的检测设备， 限制了鸡毒支 原体的快速 筛查。 [0003]环介导等温扩增(LAMP)是2000年的一种恒温检测 新方法， 通常设计两对引物， 即 外引物(F3/B3)、 内引物(FIP/BIP)， 分别结合于目的片段上具有较高的特异性。 同时， 恒温 扩增不需要变温循环， 理论上一个水浴锅就可以完成实验。 为了加快反应速度， 还可在上下 游内引物的两个组分之前设计两条环引物。 因此， LAMP技术与PCR检测技术相比， 具有反应 快速、 设备低廉、 操作简单、 特异性高等优点。 近年来， LAMP恒温检测技术被广泛地应用于食 品、 微生物、 病原体的检测中。 [0004]但是， LAMP检测技术依然具有制 约其发展的限制条件， 如： 扩增片段大小不一电泳 结果无法直观看到， 且引物数量越多， 引物错配的概率越高， 越容易造成非特异性扩增， 产 生假阳性结果， 以及检出限较高， 无法对鸡毒支原体进行早期检测。 因此， 急需发展一种简 便、 高特异性、 高灵敏度的鸡毒支 原体的快速检测方法。 发明内容 [0005]针对现有鸡毒支原体 的检测方法存在的假阳性概率高、 检出限高等问题， 本发明 提供一种 LAMP‑Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用， 利用该检测鸡毒支原体的 引物和探针可在62 ‑64℃恒温条件下快速检测鸡毒支原体， 且特异性好、 灵敏度高， 更有利 于实现对鸡毒支 原体的早期检测， 实现疾病的早发现早治疗， 有助于预防疾病的扩散 。 [0006]为达到上述发明目的， 本发明实施例采用了如下的技 术方案： [0007]一种LAMP ‑Taqman检测鸡毒支 原体的引物和探针， 包括： [0008]内引物FIP： 5 ′ ‑CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA‑3′(SEQ ID NO:1)； [0009]内引物BIP： 5 ′ ‑GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT ‑3′(SEQ ID  NO:2)； [0010]外引物F3： 5 ′ ‑CTGAACCAAAGCCAAATCC‑3′(SEQ ID NO:3)； [0011]外引物B3： 5 ′ ‑GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT ‑3′(SEQ ID NO:4)； [0012]环引物LF： 5 ′ ‑GGAGGGTTTGGCATCGGATC‑3′(SEQ ID NO:5)；说　明　书 1/8 页 3 CN 114959081 A 3