(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210662342.4 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 湖南宏雅基因技 术有限公司 地址 410001 湖南省长 沙市高新 开发区麓 天路19号综合楼全部、 车间一楼 (72)发明人 辇伟奇　唐万燕　甘鹏　宋红卫　 裴潇竹　周鑫　李正　汤红　 李弘韬　张卫　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 罗新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种HOXA 9基因甲基化检测试剂及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种HOXA9 基因甲基化检测试 剂及其应用， 所述试剂包括如SEQ  IDNO.28所示 的正向引 物序列和如SEQ  ID NO.30所示的反向 引物序列。 本发明方案制备得到的HOXA9基因甲 基化检测试剂， 不仅可以以组织作为检测样本， 还可以通过取受检者的血液快速进行乳腺癌的 检查， 规避了X线摄影等给受检者带来的辐射伤 害， 提升了乳腺癌检查的灵敏度和特异性， 给乳 腺癌检查提供了一种简单、 快速、 有效的检查方 法。 权利要求书1页 说明书14页 序列表10页 附图8页 CN 114959038 A 2022.08.30 CN 114959038 A 1.一种HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述试剂包括如SEQ  ID NO.28所示的 正向引物序列和如SEQ  ID NO.30所示的反向引物序列。 2.根据权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述HOXA9基因甲基 化检测试剂用于检测HOXA 9基因经转 化试剂修饰后的序列。 3.根据权利 要求2所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 转化试剂选自肼盐、 重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种； 优选地， 转 化试剂为重亚硫酸氢盐。 4.根据权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述HOXA9基因甲基 化检测试剂所针对HOXA9基因的检测区域为HOXA9基因或者其启动子区域； 优选地， 所述 HOXA9基因甲基化检测试剂所针对HOXA 9基因的检测区域 为如SEQ ID NO.11所示的序列。 5.根据权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述试剂还包括核 苷酸序列如SEQ  ID NO.29所示的荧 光探针序列。 6.根据权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述甲基化的检测 试剂还包括内参基因的检测试剂； 优选地， 所述的内参基因为GAPDH； 更优选地， 所述的内参 基因的检测试剂含有针对内参基因的引物和探针； 所述的内参基因GAPDH的检测试剂含有 SEQ ID NO.6和SEQ  ID NO.7所示的引物对， SEQ  ID NO.8所示的探针。 7.根据权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂， 其特征在于， 所述HOXA9基因甲基 化的检测试剂还包括DNA聚合酶、 dNTPs、 Mg2+离子、 缓冲液中的一种或几种； 优 选地， 含有DNA 聚合酶、 dNTPs、 Mg2+离子和缓冲液， 用于对HOXA 9基因进行扩增反应。 8.权利要求1所述的HOXA9基因甲基化检测试剂在制备乳腺癌诊断试剂或试剂盒中的 应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述HOXA9基因甲基化检测试剂的检测样 本选自乳腺组织、 血 液、 血清或血浆。 10.一种非疾病诊断目的检测HOXA9基因的DNA甲基化的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1、 将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处 理， 获得经修饰的待测样品； S2、 利用权利 要求1‑7任一项所述的HOXA9基因甲基化检测试剂对步骤S1经修饰的待测 样品进行HOXA 9基因甲基化情况检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959038 A 2一种HOXA9基因甲 基化检测试剂及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因诊断领域， 具体涉及一种HOXA 9基因甲基化检测试剂及其应用。 背景技术 [0002]乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下发生增殖失控的现象。 早期乳腺 癌症状多不明显， 非常容易被忽视。 目前主要的乳腺癌筛查方法包括乳腺触诊、 影像学检 查、 实验室检查。 一般， 乳腺触诊适用于对乳腺有明显肿块的患者进行检查。 影像学检查主 要包括乳腺X线检查、 乳腺超声检查以及乳腺磁共振等， 其中乳腺X线检查适用于筛查性人 群级诊断性患者的乳腺检查， 乳腺超声检查适用于所有疑诊乳腺病变的人群， 而乳腺磁共 振主要适用于乳腺X线摄影和超声对病变检出或确诊困难者和高危人群的乳腺癌筛查。 实 验室检查包括 生化检查和肿瘤标志 物的检查。 [0003]部分早期乳腺癌触诊阴性， 诊断时需要结合影像学和组织病理学的检查结果； 乳 腺X线摄影对致密型乳腺、 近胸壁肿块的显示不佳， 并且该检查有放射性损害， 对年轻女性 患者尤其是近期有生育计划的女性不作为首选检查方法； 乳腺磁共振特异性中度， 假阳性 率高， 对微笑钙化性病变显示不满意， 此外该方法检查时间长， 费用昂贵； 肿瘤标志物检查 由于其对局部病变的敏感性低， 且在某些良性疾病和 其他器官的恶性肿瘤中也可升高， 因 此， 该方法不适合用于乳腺癌的筛查和诊断。 因此， 仍亟需一种简单、 高效的可以准确检测 乳腺癌的方法。 发明内容 [0004]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种HOXA9基因甲基化检测试剂。 [0005]本发明还提出一种上述甲基化检测试剂的应用。 [0006]本发明还提出一种检测HOXA 9基因的DNA甲基化的方法。 [0007]根据本发明的一个方面， 提出了一种HOXA9基因甲基化检测试剂， 所述试剂包括如 SEQ ID NO.28所示的正向引物序列和如SEQ  ID NO.30所示的反向引物序列。 [0008]在本发明的一些实施方式中， 所述HOXA9基因甲基化检测试剂检测HOXA9基因经转 化试剂修饰后的序列； 所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶， 同时使5‑MeC基本上不受影响的试剂。 [0009]在本发明的一些实施方式中， 所述转化试剂包括肼盐、 重亚硫酸氢盐(例如重亚硫 酸氢钠等)、 亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、 亚硫酸氢钾、 亚硫酸氢铯、 亚硫酸氢铵等)、 或 在适当的反应条件下 可产生肼盐、 重亚硫酸氢盐、 亚硫酸氢盐的化 合物中的一种或几种。 [0010]在本发明的一些实施方式 中， 所述转化试剂为重亚硫酸氢盐。 [0011]在本发明的一些实施方式中， 所述的HOXA9基因甲基化的检测试剂检测经重亚硫 酸氢盐修饰后的序列。 [0012]在本发明的一些实施方式中， HOXA9基因甲基化的检测试剂所针对HOXA9基因的检说　明　书 1/14 页 3 CN 114959038 A 3