(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210626600.3 (22)申请日 2022.06.04 (71)申请人 新羿制造科技 （北京） 有限公司 地址 102299 北京市昌平区科技园区超前 路甲1号8号楼101室 (72)发明人 裴玉伟　祝令香　杨文军　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一步法检测细胞角蛋白CK 19的数字PCR试剂 盒及其应用 (57)摘要 本发明提供一步法检测细胞角蛋白CK19的 数字PCR试剂盒， 所述试剂盒是直接将样本的RNA 作为模板直接进行反转录和扩增， 进行细胞角蛋 白CK19的定量检测。 本发明首次提供了一步法检 测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒， 本发明的 试剂盒不需要前期对样品进行预富集， 大大降低 了耗费时间和人力物力。 权利要求书1页 说明书12页 序列表2页 附图2页 CN 114990200 A 2022.09.02 CN 114990200 A 1.一步法检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒是直接将样 本的RNA作为模板直接进行反转录和扩增， 进行细胞角蛋白CK19的定量检测。 2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所示试剂盒检测编码为NM_ 002276 .5的 CDS序列 ， 其中 所示试 剂盒 包括上 游 引物为 SEQ  I D No .7 : TCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGC， 下游引物为SEQ  ID No.8:CAAAGCGCGCCTCCGTTT， 探针为SEQ  ID  No.9:CACAGCTGAGCATGA AAGCTGCCTTG。 3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所示试剂盒检测编码为NM_ 002276 .5的CDS序列 ， 其中所示试剂盒包括上游引物为SEQ  ID No .10: TCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGC， 下游引物为SEQ  ID No.11:CAAAGCGCGCCTCCGTTT， 探针为SEQ   ID No.12:CACAGCTGAGCATGA AAGCTGCCTTG。 4.根据权利要求3所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 其中上游引物和下游引物浓度 分别为208nM， 探针浓度为25 0nM的组合。 5.根据权利要求3所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 其中上游引物和下游引物浓度 分别为208nM， 探针浓度为125nM的组合。 6.根据权利要求1 ‑5任一所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 核酸模板输入总量50n g‑ 100ng。 7.权利要求1 ‑6任一所述的数字PCR试剂盒的应用， 其中扩增退火温度是57.9℃或59 ℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990200 A 2一步法检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及数字PC R领域， 特别涉及一步法检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒 及其应用。 背景技术 [0002]恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要疾病类型， 而90％以上的恶性肿瘤死亡都是 由远处转移造成的。 肿瘤的远处转移大致可以分为四个阶段： 突破血管屏障进入 血液循环； 在血液循环系统中存活； 突破血管屏障进入特定的组织部位； 增殖并最终形成转移灶。 其 中， 突破血管屏障之后在血液循环系统中存活的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞 (Circulating  Tumor Cells,CTCs)。 作为恶 性肿瘤远处转移的关键环节， CTC在患者血液中 出现与否及其数量多少， 一方面代表了原发肿瘤浸润进入血管的能力， 另一方面代表了在 远端器官 形成转移灶的可能性。 [0003]外周血中的CTC数量非常稀少， 大约106‑7个白细胞中才会有1个CTC。 因此， CTC检测 首先需要根据其生物学或物理学特性进行富集， 然后再根据CTC的基因表达或功能特点对 富集到的细胞进行鉴定。 在目前所采用的技术中， 检测上皮特异基因(如细胞角蛋白CK19) 的表达是最常用的表型鉴定手段， 主要的实现形式有抗原和抗体的特异性结合、 RT ‑PCR和 NGS技术这三种。 以下对三种技 术分别做介绍。 [0004]采用抗原和抗体特异性结合的技术采用荧光标记的上皮特异抗体(CK19)检测CTC 中的上皮特异抗原的表达。 同时采用白细胞特异的CD45抗体与白细胞相结合， 作为一个排 除标准， 此外还采用细胞核染料DAPI进行染色， 以确认存在细胞核， 避免非细胞颗粒的干 扰。 经过孵育和清洗之后在荧光显微镜下观察荧光的表达情况， CK19阳性， DAPI阳性， CD45 阴性， 且符合细胞形态的事件被定义为CTC。 该方法 的优势是可以直接看到细胞， 方便在细 胞上面做进一步的其他检测。 该方法的不 足是图像扫描需要较高水平的显微镜， 成本较高， 判读起来比较费时费力， 而且容易受到主观因素以及抗体浓度、 抗体批号以及荧光曝光时 间的影响， 导 致不同批次和不同实验室之间检测结果的不 一致性。 [0005]第二种技术是通过RT ‑PCR检测上皮特异的mRNA来进行表 型鉴定， 最常用的基因就 是细胞角蛋白CK19， 根据不同的癌种可以在增加相应组织来源的基因， 比如乳腺癌可以添 加乳腺珠蛋白基因(Mammaglobin， MG)， 肺癌可以添加甲状腺转录因子1(Thyroid   Transcription  Factor‑1， TTF1)等。 为了确保核酸提取的质量， 一般还需要加入内参基因， 常用的包括GAPDH和ABL1等。 这种方法的优势是： ①充分利用了PCR的超高敏感性和特异性， 只要有特异的mRNA标志物， 就足以在超过106个白细胞中检测到1个肿瘤细胞。 因此， 该方法 对前期富集步骤的依赖度并不高， 可以直接对外周血有核细胞提取的RNA进 行检测， 这样可 以避免富集过程中的CTC损耗； ②通过使用多重PCR可以在同一个样 品中评价多个靶点， 这 使得在珍贵并且通常很有限的CTC样品中进 行多参数的处理成为可能； ③成本较低， 有成熟 的质控体系， 可以进 行自动化处理； ④检测结果相对客观， 不会受到人为影响因素的干扰等 等。 尽管有上述优势并且在一段时间之内获得了广泛的关注， 但是普通的荧光定量RT ‑PCR说　明　书 1/12 页 3 CN 114990200 A 3