(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210715790.6 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 河南农业大 学 地址 450002 河南省郑州市金 水区文化路 95号 (72)发明人 冯建灿　李奇承　陈鹏　李继东　 叶霞　郑先波　谭彬　程钧　王伟　 (74)专利代理 机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 专利代理师 袁瑞红 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一体化检测植原体的RPA引物对、 crRNA、 检 测体系及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种一体化检测植原 体的RPA 引物对、 crRNA、 检测体系及检测方法， 所述检测 方法通过设计针对植原 体16SrRNA序列保守区域 的一对RPA引物及识别该位点的双crRNA， 激活 LbCas12a的蛋白的切割活性实现对ss  DNA‑FQ荧 光的切割， 以产生明显荧光的显色技术成功检测 出多种植原体， 检测过程不超过20分钟。 本发明 具有成本低， 一体化， 灵敏度高， 特异性强和可田 间操作等特性， 显色反应效果持久明显。 检测过 程不需要任何实验室大型仪器设备， 这对实现植 原体田间快速可视化检测具有重大意义， 为植原 体的检测提供了新思路和新选择。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115029457 A 2022.09.09 CN 115029457 A 1.一种一体化识别植原体16SrRNA序列保守区域的双cr RNA， 其特征在于， 所述双crRNA 为crRNA1和crRNA2， 所述crRNA1的正向引物为T7 ‑crRNA‑F， 反向引物为crRNA ‑R1， crRNA2的 正向引物为T7 ‑crRNA‑F， 反向引物为crRNA ‑R2， 其引物序列如下： T7‑crRNA‑F： 5’ ‑TAATACGACTCACTATAG GG‑3’； crRNA‑R1： 5’ ‑GGAATTTTCGGCAATGGAGGATCTACACTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA ‑ 3’； crRNA‑R2： 5’ ‑CAATAATTCCGGATAACGCTATCTACACTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA ‑ 3’。 2.等温扩增权利要求1所述植原体16SrRNA片段的RPA引 物对， 其特征在于， 所述RPA引 物对的序列如下： RPA‑F： 5’ ‑ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT ‑3’； RPA‑R： 5’ ‑CTATGTCT TACCGCGGCTGCTGGCACATAG ‑3’。 3.一种基于CRISPR/LbCas12a/ssDNA ‑FQ一体化检测植原体的反应液体系， 其特征在 于， 所述体系包括A， B， C三个组分， 反应液总体积为2 5 μL， 其中A组分为20 μL， B组分为2.5 μL， C组分为2.5μL； 其中， A组分包含12μL的1 ×Reaction  Buffer， 2.5μL的1 ×Basic E‑Mix， 2.45μL dNTP， 1.8μL的权利要求2所述的RPA引物以及1.25μL  MgOAc； B组分包含1.25μL   ssDNA荧光探针ssDNA ‑FQ和1.25 μL的1 ×core Reaction  Mix； C组分包含权利要求1中所述 的crRNA1及crRNA 2各0.5 μL， 0.5 μL的Cas12a 蛋白以及1 μL待检测植物总DNA。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述体系的浓度为1000nM， 所述Cas12a与 crRNA1以及crRNA2的浓度比为2∶ 1∶ 1， 所述Cas12a， crRNA1及crRNA2在整个一体化检测植原 体的体系中浓度分别为1.6 μM， 0.8 μM和0.8 μM 。 5.利用权利要求3或4所述的体系可视化检测植原体的方法， 其特征在于， 所述方法包 括如下步骤： (1)以枣疯病植原体16SrRNA核苷酸序列为探针， 在NCBI数据库中运行BLAST指令共获 得76个具有代表 性的植原体16SrRNA序列， 通过与多序列对比获得其最保守区域， 设计针对 植原体16SrRNA序列的权利要求2所述RPA引物对RPA ‑F和RPA‑R， 设计并合 成权利要求1所述 crRNA的引物序列； (2)制备针对植原体16SrRNA序列保守区域的crRNA并对其进行 纯化； (3)制备所述的基于CRISPR/LbCas12a/ssDNA ‑FQ一体化检测 植原体的体系， 提取感染 植原体植物的总DNA， 以感病植物总DNA为模板加入CRISPR/Lb Cas12a/ssDNA ‑FQ体系中， 37 ℃条件下孵育15min， 体系等温扩增植原体16SrRNA序列， crRNA识别植原体16SrRNA序列后 激活LbCas12a 蛋白活性， 切割s sDNA‑FQ荧光核酸分子序列； (4)使用紫外 仪照射反应液， 若反应液表现出明显荧 光， 则表明样品中含有植原体。 6.根据权利 要求3或4所述的方法， 其特征在于， 制备针对植原体16SrRNA序列保守区域 的crRNA方法为： 1)从NBCI上下载得到具有代表性 的植原体16SrRNA核苷酸序列， 通过DNAMAN软件进行 比对分析， 选择最保守区域设计合成crRNA的引物， 正向引物为T7 ‑crRNA‑F， 反向引物为 crRNA‑R1及crRNA ‑R2； 2)将步骤1)所述引物分为两种组合T7 ‑crRNA‑F/crRNA‑R1， T7‑crRNA‑F/crRNA‑R2， 每权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029457 A 2种组合的上下游引物按照1∶1的体积比例进行混合， 在PCR仪器中进行梯度退火试验， 制备 生成crRNAs的DNA模板； 3)使用Transcript  Aid T7 High Yield Transcription  Kit对制备好的所述D NA模板 进行转录， 生成crRNA， 使用RNA ‑Clean&ConcentratorTM ‑5试剂盒纯化crRNA后， 利用 NanoDrop  2000检测crRNA浓度， 使用ddH2O将制备好的crRNA的浓度稀释至10μM； ‑80℃保 存。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述退火试验的反应体系为20μL； 包括浓 度为100 μM的T7启动 子引物T7 ‑crRNA‑F 4 μL， 浓度为100 μM的crRNA引物crRNA ‑R1及crRNA2 各4 μL， HF  5×buffer 4 μL， ddH2O 8 μL； 退火程序为： 95℃解链5min后每分钟递减1℃， 75个 循环之后降到20℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029457 A 3