(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210706287.4 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 重庆市天友 乳业股份有限公司 地址 401120 重庆市渝北区金石大道 99号 (72)发明人 张凤　祁腾　张清平　王静　唐甜　 舒希　朱旭　 (74)专利代理 机构 重庆西南 华渝专利代理有限 公司 50270 专利代理师 冯晓超 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 PCR扩增引物对及其应用 (57)摘要 本发明属于细菌检测技术领域， 具体涉及一 种PCR扩增引物对及其应用， 尤其适用于对耐热 芽孢杆菌的检测。 该PCR扩增引物对的上游引物 包含如SEQ  ID NO： 1所示序列， 下游引物包含如 SEQ ID NO： 2所示序列。 该PCR扩增引物对在检测 耐热芽孢杆菌时， 特异性强， 可 以有效与耐热芽 孢杆菌发生特异性扩增； 而且基于该PCR扩增引 物对的实时荧光PCR扩增检测方法检测耐热芽孢 杆菌时， 90min左右即可完成检测， 检测时间短； 检测牛乳中耐热芽孢杆菌的检测限可以达到 11CFU/mL， 灵敏度高。 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图6页 CN 114990242 A 2022.09.02 CN 114990242 A 1.PCR扩增引物对， 其特征在于， 上游引物包含如SEQ  ID NO： 1所示序列， 下游引物包含 如SEQ ID NO： 2所示序列。 2.检测试剂， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的PCR扩增引物对。 3.根据权利要求2所述的检测试剂， 其特征在于， 还包括标记试剂， 标记试剂包括但不 限于荧光染料或荧 光探针。 4.检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中 任一所述的检测试剂。 5.权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中任一所述的检测试剂或权利要 求4所述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。 6.耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法， 其特征在于， 包括： 将待检测 DNA模板使用权利要 求1所述的PCR扩增引物对进 行PCR扩增得P CR扩增产物， 对PCR扩增产物进行分析， 从而判断 待检测DNA模板中是否含有耐热芽孢杆菌 。 7.耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法， 其特征在于， 包括： 待检测DNA模板与权利要求3 所述的检测试剂混合后进 行PCR扩增， 在P CR扩增过程中， 根据荧光信号判断待检测DNA模板 中是否含有耐热芽孢杆菌； 根据CT值和标准曲线判断待检测DNA模板中耐热芽孢杆菌的含 量。 8.根据权利要求6或7所述的耐热芽孢杆菌的PCR检测方法， 其特征在于， PCR扩增的退 火温度为5 6℃‑60℃。 9.根据权利要求6或7所述的耐热芽孢杆菌的PCR检测方法， 其特征在于， 待检测DNA模 板浓度为： 0.5 μL/20 μL＜ 待检测DNA模板浓度＜2 μL/20 μL。 10.根据权利要求6或7所述的耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法， 其特征在于， 耐热芽 孢杆菌为牛乳中耐热芽孢杆菌， 耐热芽孢杆菌的P CR扩增检测方法还包括在P CR扩增检测前 对待检测牛乳进 行前处理， 其中， 前 处理包括： (1)将待检测牛乳离心去除上清液和脂肪， 过 滤除尽牛乳； (2)使用无菌纯水进行等体积 重悬， 离心保留上清液； (3)上清液在95℃ ‑105℃ 进行金属浴， 速冻和冻融。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990242 A 2PCR扩增引物对及其应用 技术领域 [0001]本发明属于细 菌检测技术领域， 具体涉及一种PCR扩增引物对及其应用， 尤其适用 于对耐热芽孢杆菌的检测。 背景技术 [0002]耐热芽孢杆菌Bacillussporothermodurans(BSTD)是一类具有较高耐热性能的可 以产内生孢子的细菌。 19世纪80现代， 在德国的超高温杀菌处理(UltraHeatTreated， UHT) 的牛奶中发现BSTD， 随后在欧洲的其他国家该菌也相继被发现。 Bertil在 1996年对BSTD进 行研究并命名， 该菌种是细菌界， 厚壁菌门， 杆菌纲， 芽孢杆菌目， 芽孢杆菌科， 芽孢杆菌属， BSTD种； 该菌种的模型菌种编号 为M215(D SMZ10599)。 [0003]BSTD可能在一些食品或环境中存活并繁殖， 由于该菌不会明显改变食品的品质和 口感， 也不具有致病性， 很容易在微生物检测时被忽视， 而且有研究表明食品中所检测到的 芽孢杆菌可能经历 土壤、 饲料、 消化、 粪便和泌乳等环节， 说明BSTD生存及繁殖能力比较强， 不排除会给食品安全带来潜在的风险。 尤其在乳制品中， 由于牛乳是细菌繁殖的最佳培养 基， 芽孢杆菌及其芽孢在原料乳中出现的概率很高； Hammer等人的研究表明， 牛奶经过在30 ℃下培养5d， 其所含的BSTD可达到105CFU/mL。 虽然BSTD不会导致乳制品变质， 也不具有致 病性， 但会直接影响到乳制品的品质， 同时也能够反映出产品的生产过程存在瑕疵， 还存在 未知的风险； 而且， 国家对牛乳中微生物的新国标要求不高于200万个/毫升， 这就需要对 BSTD有全面而深入的认 识， 从而使乳制品企业建立更加完 善的微生物控制体系。 [0004]以上， 由于食品企业尤其是乳品企业需要对BSTD进行实时监控， 实现工业生产上 对该芽孢杆菌的有效防控， 所以一种有效检测耐热芽孢杆菌的方法是必要的。 发明内容 [0005]为了解决上述问题， 本发明目的之一在于提供了一种PCR扩增引物对， 该PCR扩增 引物对对耐热芽孢杆菌有很强的特异 性， 使用该P CR扩增引物对可以通过P CR扩增检测方法 对耐热芽孢杆菌进行定性和定量分析。 [0006]为了达到上述目的， 可以采用以下技 术方案： [0007]本发明一方面提供了一种PCR扩增引物对， 其上游引物 可以包含如SEQIDNO： 1所示 序列， 下游引物可以包 含如SEQIDNO： 2所示序列。 [0008]本发明另一方面 提供了一种检测试剂， 可以包括上述的PCR扩增引物对。 [0009]本发明再一方面提供了一种检测试剂盒， 可以包括上述的PCR扩增引物对或上述 的检测试剂。 [0010]本发明再一方面提供了一种上述的PC R扩增引物对或上述的检测试剂或上述的检 测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。 [0011]本发明再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法， 包括： 将待检测 DNA模板使用上述的P CR扩增引物对进行PCR扩增得PCR扩增产物， 对PCR扩增产物进行分析，说　明　书 1/11 页 3 CN 114990242 A 3