(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211179269.1 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 江苏迅睿生物技 术有限公司 地址 221000 江苏省徐州市经济技 术开发 区新微半导体加速 器17、 19、 2 2号楼 (72)发明人 陈新利　魏爱琪　李美琼　傅明华　 徐晓伟　聂晶　 (51)Int.Cl. G01N 33/558(2006.01) G01N 33/532(2006.01) G01N 33/548(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 N基因检测引物及探针组、 层析试纸条、 制备 方法、 检测试剂盒、 检测方法 (57)摘要 本申请公开了一种N基因检测引物及探针 组、 层析试纸条、 制备方法、 检测试剂盒、 检测方 法； 属于生物 检测技术领域； 所述检测SARS ‑CoV‑ 2病毒N基因的引物探针组合特异性扩增 并检测 SARS‑CoV‑2病毒的N基因。 本申请研发的引 物探 针可以保证快速、 高效、 特异性地对目的片段进 行扩增， 扩增时间仅需10min， 最低检测拷贝数可 达200 copies/ml； 扩增产物 检测形式为试纸条， 肉眼鉴定， 无需仪器辅助； 且扩增过程无需变温 和类似于PCR仪等复杂装置， 只需要将反应温度 控制在39 ‑42℃即可。 权利要求书3页 说明书9页 附图2页 CN 115541875 A 2022.12.30 CN 115541875 A 1.一种层析试纸， 包括PVC底板、 样品垫、 结合垫、 检测垫、 吸水垫； 沿着层析溶液的流动 方向， 样品垫、 结合垫、 检测垫、 吸水垫依次布置在PVC底板上； 样品垫、 结合垫、 检测垫、 吸水 垫相邻的两种结构搭接连接； 其特征在于， 结合垫中包含： FAM抗体 ‑显色颗粒复合物、 DNP ‑显色颗粒复合物， 所述FAM 抗体‑显色颗粒复合物经由显 色乳胶微球与FAM抗体 混合反应形成； 所述DNP ‑显色颗粒复合 物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成； 所述检测垫包括硝酸纤维素膜， 在检测垫上设置检测区： 其经由抗地高辛抗体加载在 硝酸纤维素膜上 形成； 所述检测抗 地高辛抗体是由抗 地高辛抗体与磷酸缓冲液组成； 在检测垫上设置对照区： 其经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成； DNP抗体由DNP 多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。 2.根据权利要求1所述的一种层析试纸， 其特征在于， 所述的显色颗粒均为红色乳胶微 球。 3.根据权利要求2所述的一种层析 试纸， 其特 征在于， 所述乳胶微球粒径为 400nm。 4.如权利要求1所述的一种层析 试纸的制备 方法， 其特 征在于， 其包括如下步骤： S100， 制作结合垫： 制备显色颗粒溶液， 将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体 ‑显色颗粒复合 物， 将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP ‑显色颗粒复合物， 将FAM抗体 ‑显色颗粒复合 物、 DNP‑显色颗粒复合物加载到结合垫上； S200， 制作检测垫： 抗地高辛抗体和DNP抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区； S300， 制备试纸大板： 样本垫、 结合垫、 检测垫、 吸水垫依次布置在PVC底板上形成试纸大板； 其中， 结合垫与 检测垫两者部分重合， 吸水垫与检测垫 两者部分重合； S400， 制备层析 试纸， 将步骤三中制备的试纸大板进行裁切， 制备成检测试纸。 5.如权利要求4所述的一种层析试纸的制备方法， 其特征在于， 若有SARS ‑CoV‑2病毒， 其N基因在经过扩增体系后会产生扩增产物； 扩增产物首先与样本垫结合， 然后经过结合 垫， 其在经 过结合垫时， 扩增产物的FITC标签与FAM抗体 ‑显色颗粒复合物结合； 再经过检测垫： 经过检测区时， 扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地 高 辛抗体结合使检测区显色； 经过对照区， 溶液在经过结合垫时， 必然会混入DNP ‑显色颗粒复合物， 溶液在层析试纸 流动的时候， 经 过对照区时， DNP ‑显色颗粒复合物会与DNP抗体结合， 对照区显色。 6.一种2019‑CoV‑2病毒N基因检测引物及探针组， 其特征在于， 所述的引物的核苷酸序 列为： 上游引物序列： C CAAACTGTCACTA AGAAATCTGCTGCTGAG 下游引物序列： [5’ ‑Digoxin]‑ATCAGTTCCTTGTCTGAT TAGTTCCTGGTCC 探针序列： [5’FAM]‑CTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCAC[THF]AAAGCATACAATGTA  ACAC‑[3’ C3spacer]。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115541875 A 27.如权利要求6所述的一种2019 ‑CoV‑2病毒N基因检测引物及探针组， 其特征在于， 所 述引物、 探针有四个修饰位 点： 在下游引物5 ’端标记Digoxi n； 探针5’端标记FAM； 探针距离 5’端约30nt、 距离 3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位 点； 探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团。 8.如权利要求7所述的一种2019 ‑CoV‑2病毒N基因检测引物及探针组， 其特征在于， 所 述阻断基团采用C 3‑spacer修饰。 9.一种检测试剂 盒， 其特征在于， 其包括如权利要求6所述的引物及探针组、 权利要求1 所述的层析 试纸。 10.一种非诊断目的2019 ‑CoV‑2病毒检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1,配置反应 体系： 其中， 所述的引物及探针组为权利要求6所述的引物及探针组； S2， 在S1中配制的体系溶解恒温扩增 混合酶冻干微球， 酶冻干微球包括： T4  UvsX重组 酶、 T4 UvsY蛋白、 Bsu  DNA聚合酶、 逆转录酶、 gp32蛋白、 冻干骨架； 其中， 冻干骨架为蔗糖；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115541875 A 3