(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211268032.0 (22)申请日 2022.10.17 (71)申请人 深圳市先康达生命科 学有限公司 地址 518110 广东省深圳市龙华区观澜街 道新澜社区观光路1301-76号银星智 界二期1号楼B213 (72)发明人 谢海涛　马丽雅　都晓龙　 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 15/67(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种两级Syn Notch逻辑调控结构及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种两级SynNotch逻辑调控 结构及其应用； 该两级SynNot ch逻辑调控结构 包 括靶点结合区域、 Not ch core区和启动调控蛋白 区， 且该两级SynNotch逻辑调控结构分为一级 SynNotch逻辑调控结构和二级SynNotch逻辑调 控结构， 而 二级SynNotch逻辑调控结构的表 达受 到一级SynNotch逻辑调控结构的调控。 该 发明两 级SynNot ch可以使免疫细胞形成浸润效果， 解决 了传统CAR结构的常时激活导致的免疫细胞提前 耗竭问题、 免疫细胞的增殖浸润问题、 免疫细胞 的过度杀伤及可能发生严重副反应的问题和肿 瘤微环境的改善问题， 极大的提高了对于肿瘤的 杀伤能力及免疫细胞治 疗的安全性。 权利要求书1页 说明书11页 附图18页 CN 115505601 A 2022.12.23 CN 115505601 A 1.一种两级SynNotch逻辑调控结构， 其特征在于， 所述逻辑调控结构分为一级 SynNotch逻辑调控结构和二级SynNotch逻辑调控结构， 且二级SynNotch逻辑调控结构的表 达受到一级SynNotch逻辑调控结构的调控； 该SynNotch逻辑调控结构包括靶点结合区域、 Notch core区和启动调控蛋白区。 2.根据权利要求1所述的两级S ynNotch逻辑调控结构， 其特征在于， 所述一级S ynNotch 逻辑调控 结构的靶点结合区域为第一靶点， 该第一靶点靶向FAP蛋白； 所述一级SynNotch逻 辑调控结构的启动调控蛋白区为第一启动调控蛋白GAL 4‑VP64。 3.根据权利要求2所述的两级S ynNotch逻辑调控结构， 其特征在于， 所述一级S ynNotch 逻辑调控结构用于调控靶向CLDN18.2蛋白的嵌合抗原受体基因、 IL ‑7和CCL‑19细胞因子基 因、 iCas9自杀基因及二级SynNotch逻辑调控 结构基因表达， 且所述CLDN18.2蛋白的嵌合抗 原受体基因、 IL ‑7和CCL‑19细胞因子基因、 iCas9自杀基因及二级SynNotch逻辑调控结构基 因序列前分别包含有 可与所述第一启动调控蛋白GA L4‑VP64相匹配结合的第一调控蛋白结 合区的核酸序列UAS。 4.根据权利要求1所述的两级S ynNotch逻辑调控结构， 其特征在于， 所述二级S ynNotch 逻辑调控结构的靶点结合区域为第二靶点， 该第二靶点靶向CLDN18.2蛋白； 所述二级 SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区为第二启动调控蛋白tetR。 5.根据权利要求4所述的两级S ynNotch逻辑调控结构， 其特征在于， 所述二级S ynNotch 逻辑调控 结构用于调控NAP蛋白基因表达， 且 所述NAP蛋白基因序列前包含有 可与所述第二 启动调控蛋白tetR相匹配结合的第二调控蛋白结合区的核酸序列tTA。 6.一种表达盒， 其特征在于， 所述表达盒包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch 逻辑调控结构。 7.一种载体， 其特征在于， 所述载体包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch逻辑 调控结构， 或者包 含权利要求6所述的表达盒。 8.一种重组细胞系， 其特征在于， 所述重组细胞系包含权利要求1至5任一所述的两级 SynNotch逻辑调控结构、 或者包含权利要求6所述的表达盒、 或者包含权利要求7所述的载 体。 9.一种生物制剂， 其特征在于， 所述生物制剂包含权利要求1至5任一所述的两级 SynNotch逻辑调控结构、 或者包含权利要求6所述的表达盒、 或者包含权利要求7所述的载 体、 或者包 含权利要求8所述的重组细胞系。 10.根据权利要求9所述的生物制剂在治疗和/或预防肿瘤和/或癌症药物方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505601 A 2一种两级SynNotch逻 辑调控结构及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及细胞基因 改造技术领域， 尤其涉及一种两级SynNotch逻辑调控结构及 其应用。 背景技术 [0002]肿瘤 （tumour） 是指机体在各种致瘤因子作用下， 局部组织细胞增生所形成的新生 物 （neogr owth） ， 因为这种新生物多呈占位性块状突起， 也称赘生物 （neoplasm） 。 其中， 恶性 肿瘤因易发生 转移， 治疗后易复发且在某些 特殊的微环境下导 致极难治愈 。 [0003]IL‑7是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白， 分子量为25KD； 其基因位于第8号染色体。 现多采用基因工程手段， 从转染含IL ‑7CDna表达性质粒的哺乳类细胞培养上清 中获取IL ‑ 7。 IL‑7的靶细胞主要为淋巴细胞， 对来自人或小鼠骨髓的B祖细胞、 胸腺细胞及外周成熟的 T细胞等均有促生长活性。 其功能有： ①与干细胞生长因子 （S CF） 协同能够刺激b前体发生有 丝分裂， 这一效应可被TGF所抑制； 但对B祖细胞 （pro ‑B） 的生长没有明显作用。 ②促进双阴 性胸腺细胞的成熟， 提供胚胎胸腺细胞发育过程中TCR基因重组的始动信号； 但对成熟T细 胞无明显作用。 ③诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生LAK细胞活性， 其效应细胞主要为 CD8+亚群； 但IL ‑7诱导的LAK细胞不具有NK 活性。④IL‑7能刺激髓样前体细胞和巨核细胞产 生集落形成单位和血小板， 使机体从环磷酰胺的免疫抑制作用中恢复过来； 在较高浓度时， IL‑7还能增强巨噬细胞的细胞毒活性， 诱 导单核细胞分泌细胞因子 。 [0004]CCL‑19 属于 CC 类趋化因子， 又称  EB 病毒诱导分子(  EBV‑induced molecule   1 ligand chemokine， ELC)或人巨噬细胞炎性蛋白  3β (macrophage  inflammatory   protein‑7eta， MIP ‑3β )， 编码基因定位于9号染色体 短臂上， 主要在次级淋巴组织和器官如 脾和淋巴结的T细胞中表达， 趋化幼稚T细胞和成熟D C细胞。 有研究发现， CCL ‑19在抗肿瘤中 起诱导T细胞、 DC细胞和NK细胞作用， 这类免疫细胞浸润到肿瘤组织中各自发挥免疫功能， 如细胞毒性、 抗原提呈、 吞噬和分泌细胞因子来抑制肿瘤生长。 在特定的环境下， 免疫细胞 识别并攻击肿瘤细胞， 从而发挥 抗肿瘤作用。 近年来也有研究发现， CCL ‑19 可直接与CCR ‑7 受体结合激活 受体后通路抑制肿瘤增殖、 迁移及侵 袭。 [0005]幽门螺杆菌 （Hp） 中性粒细胞激活蛋白 （Neutrophil  activating protein， NAP） 是 Hp感染所致胃炎的重要致病因子之一， 它促进了炎性细胞中性粒细胞、 单核细胞在胃黏膜 的聚集， 并释放大量的炎症因子， 同时诱导氧化活性产物的产生， 导致胃黏膜损伤。 然而， NAP具有多种生物活性， 它可作为配体， 激活  Toll样受体 （Toll  Like receptor， TLR2） 促使 以分泌IFN ‑γ为主的Th1免疫应答并抑制Th2免疫反应， 为支气管哮喘、 过敏等Th2免疫为主 的疾病提供了新的治疗手段。 同时有 学者发现NAP通过激活细胞毒Th1免疫应答抑制了小鼠 膀胱癌、 肝癌的生长 。 [0006]传统的Notch信号通路包括Notch受体、 Notch配体、 细胞内效应分子、 DNA结合蛋 白、 受调控的下游基因等。 Notch受体是跨膜受体， 当胞外域结合到Notch配体后， 细胞运动 致使s2位点暴露， 被金属蛋白酶等识别切割， 释放胞内段入核， 从而启动下游基因表达。说　明　书 1/11 页 3 CN 115505601 A 3