ICS 65.020.20 CCS B 21 46 海 南 省 地 方 标 准 DB 46/T 536—2021 西番莲(百香果)种苗病毒检测技术规程 Technical regulations of detection for virus in passionfruit seedling 2021 - 08 - 02 发布 2021 - 09 - 01 实施 海南省市场监督管理局 发 布 DB 46/T 536—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由海南省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、农业农村部热带作物种子种苗质量监 督检验测试中心。 本文件主要起草人：王健华、应东山、尹慧祥、余乃通、刘志昕、王军、王辉。 I DB 46/T 536—2021 引 言 西番莲（百香果）容易被多种植物病毒侵染，以马铃薯Y病毒属（Potyvirus）为主，该属侵染西番 莲的常见病毒有东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus，EAPV）、西番莲斑驳病毒（Passion fruit mottle virus，PaMV）、西番莲木质化病毒（Passion fruit woodiness virus，PWV）、夜来香 花叶病毒（Telosma mosaic virus，TeMV）等。 为提高检测效率， 简化检测流程，本文件不针对单个种进行逐一检测，而拟采用属的通用检测方法， 以马铃薯Y病毒属（Potyvirus）为检测对象，同时检出该属内的多种病毒，以期满足西番莲种苗生产和 调运过程中的病毒检测基本需求。 II DB 46/T 536—2021 西番莲(百香果)种苗病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了西番莲（Passiflora sp.）种苗病毒检测的术语和定义、检测对象、抽样方法、检测 方法、质量要求和处理办法。 本文件适用于西番莲种苗生产及调运过程中的病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 401—2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY/T 3179—2018 甘蔗脱毒种苗检测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 原种 elit 用来繁育采穗母株、且未检出本文件规定的检测对象的西番莲种苗。 3.2 采穗母株 spike picking plant 用原种作种苗，在防虫网室、温室等严格隔离条件下保存或扩繁，专门为生产西番莲种苗提供嫁接 接穗和扦插枝条的西番莲植株。 3.3 带毒率 virus-carrying rate 西番莲种苗中受病毒侵染的植株的比率。 3.4 病毒病显症率 virus-symptom rate 西番莲种苗中出现病毒病症状的植株的比率。 4 检测对象 马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。 1 DB 46/T 536—2021 5 抽样方法 5.1 原种 每株必检，每3个月进行病毒检测1次。 5.2 采穗母株 采穗圃每半年检测1次，每株一年内至少被抽检1次。 5.3 商品苗 同一批生产批次或同一调运批次的种苗为同一检验批。采用随机抽样方法,按同一检验批不小于0.5% 的比例抽样，最低抽样数量为20株。 6 检测方法 6.1 试纸条检测法 6.1.1 适用情形 种苗生产和调运过程中需要在现场快速获知病毒检测结果的情形。 6.1.2 采样方法及样品保存 每株取淡绿期展开叶片1张，单独放到封口塑料采样袋里，挤掉袋内空气，密封后妥善保存。样品 在2 ℃～8 ℃条件下保存，保存期不应超过3 d；若需长期保存，需放置-80 ℃冰箱，且避免反复冻融。 6.1.3 操作方法 用马铃薯Y病毒属的通用检测试纸条进行现场快速检测。具体操作方法按产品说明执行。 6.1.4 结果判定 试纸条远液端控制线位置出现反应条带时，检测结果方可信。试纸条插入反应液中20 min左右检测 线位置出现反应条带的，样品判定为Potyvirus阳性，未出现反应条带的，判定为阴性。 6.2 酶联免疫吸附测定（ELISA）法 6.2.1 适用情形 样品数量较多（一般40份以上），宜用ELISA检测法。适用于检测采穗母株。 6.2.2 采样方法及样品保存 按照6.1.2给出的要求执行。 6.2.3 操作方法 用马铃薯Y病毒属的通用抗血清进行ELISA检测。用已知含马铃薯Y病毒属的西番莲样品做阳性对照， 用已知不含马铃薯Y病毒属的西番莲样品做阴性对照，用无菌水替代样品做空白对照。操作方法按NY/T 401—2000的附录A规定执行。 6.2.4 结果判定 2 DB 46/T 536—2021 阳性对照、阴性对照和空白对照的检测结果均与预期相符时，检测结果方可信。被检样品与阴性对 照之间的OD405值比值≥2时，样品判定为Potyvirus阳性，比值＜2时，判定为阴性。 6.3 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法 6.3.1 适用情形 检测样品数量较少（一般少于10份）、且对检测精度要求较高时，宜用RT-PCR检测法。适用于检测 西番莲原种。 6.3.2 采样方法及样品保存 按照6.1.2给出的要求执行。 6.3.3 操作方法 用马铃薯Y病毒属通用引物进行RT-PCR检测，其中上游引物：5’-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3’，下 游引物：5’-AYYTGYTYMTCHCCATCCATC-3’，退火温度45 ℃，目标片段：680 bp。用含目标病毒扩增片段 的质粒做阳性对照，用不含目标病毒扩增片段的质粒做阴性对照，用无菌水替代样品做空白对照。操作 方法按NY/T 3179—2018的附录C规定执行。 6.3.4 结果判定 阳性对照、阴性对照和空白对照的检测结果均与预期相符时，检测结果方可信。被检样品电泳泳道 出现约680 bp大小的电泳条带，样品判定为Potyvirus阳性，否则判定为阴性。 6.4 目测检查 6.4.1 适用情形 用做判断种苗是否带毒的辅助手段，可做为种苗生产过程中预防病毒病、提高种苗质量的日常性管 理措施。 6.4.2 操作方法 对抽检的西番莲种苗进行病毒病目测检查，西番莲病毒病常见症状参见附录A。按公式（1）计算病 毒病显症率。 ＝ ················（1） 式中， a —— 病毒病显症率，以百分率表示，结果保留一位小数； v —— 出现疑似病毒病症状的样品数量，单位为株； t —— 种苗样品总数量，单位为株。 6.5 检测记录与检测报告 检测应留存试纸条显色结果照片、酶联板的OD405读数、凝胶电泳图、病毒病症状图等原始关键数据。 检测报告应明确以阴性或阳性标明各被检样品的检测结果，并按公式（2）计算样品的带毒率。 ＝ ················（2） 式中， 3 DB 46/T 536—2021 b —— 带毒率，以百分率表示，结果保留一位小数； p —— 出现阳性检测结果的样品数量，单位为株； t —— 种苗样品总数量，单位为株。 7 质量要求 西番莲种苗质量要求见表1。 表1 种苗质量要求 项 目 原种 采穗母株 商品苗 病毒病显症率（%） 0 ≤2.0 ≤5.0 带毒率（%） 0 0 ≤3.0 8 处理办法 出现病毒病症状或检测为阳性的原种和采穗母株，立即拔除并进行无害化处理。经过1次无害化处 理的原种和采穗母株，按本文件规定的抽样方法进行第2次检测，仍未能达到表1要求的，不可再用于繁 育种苗。病毒病显症率和带毒率未能达到表1要求的商品苗，可判定为不合格。 4 DB 46/T 536—2021 附 录 A （资料性） 西番莲（百香果）常见病毒病症状 表A.1给出了西番莲（百香果）常见病毒病的症状类型、特征描述和图示。 表A.1 西番莲（百香果）常见病毒病症状 症状类型 花叶 斑驳 畸形 蚀纹 特征描述 症状图示 由形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，不 同颜色部位的轮廓清楚 由形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，但 变色部位的轮廓不清楚 植物整株或局部的形态异常，常见的有矮化和矮缩，叶片的 畸形主要表现为叶片变小、叶缺和叶面高低不平的皱缩 叶片表皮细胞死亡所形成的各种斑纹现象 _________________________________ 5