65.020 CCS B 41 ICS DB 63 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/T 1968—2021 高寒地区陆生野生动物疫病监测样品采集 技术规范 2021 - 10 - 28 发布 青海省市场监督管理局 2022 - 01 - 01 实施 发 布 DB 63/T 1968—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由青海省林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：青海省动物疫病预防控制中心、青海省野生动物疫源疫病监测总站。 本文件主要起草人：林元清、马万军、阚威、王云平、孙万桂、赵旭阳、于春梅、何振邦、张总超、 孙生祯、游潇倩、张晓英、王晓婷、邓梅、才加、陈继勇、索南斑久、马丽娅、马艳萍。 本文件由青海省林业和草原局监督实施。 I DB 63/T 1968—2021 高寒地区陆生野生动物疫病监测样品采集技术规范 1 范围 本文件规定了高寒地区陆生野生动物疫病监测采样对象、采样原则、采样前准备、样品采集、样品 记录、样品保存、样品包装、样品运送、无害化处理、环境消毒、安全防护等技术内容。 本文件适用于开展野生动物疫病实验室检测所需样品的采集、保存和运送。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 DB63/T 1652 病害动物及病害动物产品无害化处理技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高寒地区陆生野生动物疫病 指高寒地区陆生野生动物所携带病原体，可在高寒地区陆生野生动物之间传播、流行，对高寒地区 陆生野生动物种群构成威胁或者可能传染给人类、家畜和家禽的传染性动物疫病。 3.2 样品采集 通过特定的方法，按照特定的程序和要求，对反映高寒地区陆生野生动物个体、群体或环境有关状 况的实验室检测样品进行收集、处理及整理的过程。 4 采样对象 高寒地区常见陆生野生动物主要包括： a) 哺乳类：野牦牛、藏野驴、野猪、马鹿、白唇鹿、盘羊、藏羚羊、岩羊、普氏原羚、雪豹、狼、 豺、猕猴等、狐狸、猞猁、荒漠猫、旱獭、野兔、青海田鼠、高原鼠兔、蝙蝠等。 b) 鸟类：渔鸥、鸬鹚、赤麻鸭、绿头鸭、翘鼻麻鸭、秃鹫、斑头雁、灰雁、黑颈鹤、血雉、藏马 鸡、雪鸽、岩鸽、原鸽等。 5 采样原则 1 DB 63/T 1968—2021 5.1 活体野生动物以捕获方式采样，主要采集血液、口鼻、粪便拭子和体液样品等，采样前要有正确 的保定措施。死亡野生动物应尽快解剖后采集各组织样品，并对病变部分进行描述和记录。发现野生动 物尸体疑似感染炭疽时不应剖检。 5.2 野生动物发生异常死亡时，应调查了解异常死亡情况所涉及的野生动物种类、种群数量、死亡数 量、地理坐标和异常事件涉及的地理范围等。除采集患病或死亡野生动物样品外，还应包括周围水、土 壤、植被等环境样品，以及其他被认为对死亡产生作用因素的样品。 5.3 宜使用一次性器皿，玻璃、陶制等器皿以及刀、剪、镊子等采样器械使用前应煮沸或高压灭菌。 采集每个样品前用酒精擦拭和火焰消毒采样器械。每份样品应单独使用一套器皿。对采样部位做好消毒。 6 采样前准备 6.1 采样工具 采血器、采血管、离心管、无菌棉拭子、样品袋、剪刀、镊子、解剖刀、酒精灯、酒精棉、平皿、 玻片、探杯、试管架、冷藏箱、冰袋、采样单、签字笔、记号笔、不干胶标签、记录本等。 6.2 保存液 根据采样需要，准备PH7.4磷酸盐缓冲液、50%甘油盐水缓冲液、阿氏液、10%福尔马林固定液、无 水乙醇等保存液。 6.3 防护及消毒用品 手套、口罩、防护服、防护帽、护目镜、防水胶鞋、酒精、消毒洗手液、喷雾器、消毒药等。 7 安全防护 7.1 在进入采样现场前，应充分了解周围环境、气候条件、野生动物活动和异常情况等，对可能出现 的安全风险做好预防措施。 7.2 采样人员和密切接触野生动物人员在开展工作前应穿（戴）好防护用具，结束后要按正确的程序 脱掉防护用品，并做好洗手消毒。 7.3 采样期间不应进行饮水、进食、吸烟等活动。避免徒手捕捉，防止被动物咬伤、抓伤。野生动物 疫病采样和检测从业人员应定期进行健康检查。 8 样品采集 8.1 血液样品 8.1.1 采血部位 大动物在颈静脉、前腔静脉、耳静脉、尾静脉等。小动物小量采血可穿刺耳尖、耳廓外静脉，多量 采血采用心脏采血或剪端尾尖部采血。鸟类在翅静脉采血或采用心脏采血。 8.1.2 血液样品处理 宜使用一次性采血器采集血液样品。用加入抗凝剂的采血管，或将血液注入加入0.1%肝素钠、阿氏 液或枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，并充分混匀采集抗凝血。将采血管以15度～30度倾斜角在室温下静止 2 DB 63/T 1968—2021 2 h～4 h或置4 ℃冰箱过夜，待血液凝固大部分血清析出后，轻轻吸取上层液分离血清。必要时可低速 离心分离血清。将抗凝血血细胞自然下沉或离心分离血浆。 8.2 口、鼻、泄殖腔拭子及粪便 用无菌棉签伸入野生动物口、鼻、肛门或泄殖腔沾取分泌物，浸入含保存液的采样管中剪去露出部 分并盖紧瓶盖。野生动物粪便须采集新鲜粪便并置于含保存液的采样管或样品袋中。 8.3 组织样品 8.3.1 病原学检测样品 剥离动物皮肤后用消毒器械依次打开腹腔、胸腔以及头骨，采集淋巴结、肝、肾、脾、胃、胰腺、 2 2 心、肺、脑等组织样品，大小约1 ㎝ ～2 ㎝ 。进行病原分离所需样品须注意消毒和无菌操作。 8.3.2 组织病理学检测样品 采集病健交界处的组织块，置入10倍于组织块的10%的甲醛溶液或多聚甲醛中固定。组织厚度不超 过0.5 ㎝，组织块不应挤压、刮摸和用水洗。 8.3.3 皮肤样品 有水泡或皮肤病变疾病的野生动物，采集病变部位皮肤的碎屑以及未破裂水泡液、水泡皮作为样品。 8.3.4 肠道及内容物 肠道应选择病变最明显的部分。内容物用生理盐水冲洗收集，也可扎穿肠壁用吸管吸取内容物，并 在灭菌的30%甘油生理盐水缓冲液中保存。或将带有内容物的肠管两端双线结扎并剪断保存。 8.4 体液样品 8.4.1 精液及尿液 所采精液样品应包括“富精”部分，盛装于无菌试管中避免防腐剂污染。在野生动物排尿时用洁净 的容器直接接取中段尿液，或从死亡动物膀胱中抽取尿液。 8.4.2 子宫阴道内分泌物和外生殖器包皮内分泌物 将消毒好的吸管插入子宫颈口或阴道内，向内注射少量营养液或生理盐水，用吸球反复抽吸几次后 注入培养液中。用软胶管插入公畜的包皮内，向内注入少量的营养液或生理盐水，多次揉搓冲洗，收集 冲洗液注入无菌容器中。 8.4.3 胃液及呼吸道分泌物 将多孔的胃管送入胃内，其外端接在吸引器的负压瓶上，加负压后胃液自动流出。用灭菌棉拭子采 集咽喉或气管内分泌物，沾取分泌物后将拭子浸入保存液中。 8.4.4 脑脊液 采用穿刺法，在颈椎环枢孔和腰椎腰荐孔，术部经剪毛消毒后，用专用的穿刺针垂直缓慢刺入蛛网 膜下腔，拔出针芯，脑脊液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器中。 8.4.5 其他液体 3 DB 63/T 1968—2021 采集胆汁、脓、黏液和关节液等样品时，消毒采集部位后用采血器插入并吸取内部液体材料。也可 用接种环经消毒部位插入，提取病料直接接种到培养基或涂布到玻片上。 8.5 胚胎及胎儿 选取无腐败的胚胎、胎儿或胎儿的实质器官装入无菌塑料袋。 8.6 其他 监测环境样品，可从遗弃物、巢穴、洞穴等采集有代表性的样品。 9 样品记录 9.1 对样品用记号笔在样品袋或器皿上进行连续性编号，样品编号须与送检（采样）单中编号一致。 制成的涂片、触片上注明编码并另附说明。 9.2 送往实验室的样品应附有送检（采样）单，并备份存档，参见附录 A。 9.3 样品记录内容包括样品编号、动物名称、样品种类、样品数量、采样地址（坐标）、动物发病死 亡时间、临床症状、预检项目、采样日期、送检单位等。 10 样品保存 10.1 采集的样品在无法及时送检的情况下，应根据不同的检验要求和所需温度分类保存于冰箱中。 10.2 血清放-20 ℃冻存，全血暂时放 4 ℃冰箱保存。血液样品要尽量减少反复冻融。 10.3 细菌检测样品应 4 ℃保存，病毒检测样品应在 0 ℃以下低温保存。 11 样品运送和包装 11.1 采集的样品应及时送检，需低温保存的样品送样时用放有冰袋的冷藏箱或车载冰箱。 11.2 样品的包装用主容器、样品袋、冷藏箱三重包装的方式，要保证防水、防漏、密封性良好。 11.3 血清分离后盖好离心管，玻璃器皿加垫缓冲材料防止破裂。玻片两端用细木条分隔开，层层叠加， 底层和最上层涂面向内，用细线包扎好。 11.4 若检测样品是用于重大动物疫病，如禽流感、口蹄疫、非洲猪瘟等，应按照 NY/T 541 规定执行。 12 无害化处理 12.1 一次性采样器械应进行生物安全无害化处理，可重复使用的器械应先清洗消毒后方可再次使用。 12.2 样品采集结束后无法达到检测要求的样品和残余尸体以及实验室废弃物要进行无害化处理。参见 DB63/T 1652 执行。 13 环境消毒 样品采集结束后对现场和污染的环境进行彻底消毒。常用消毒药有3%氢氧化钠、 0.2%过氧乙酸、0.5% 次氯酸钠、生石灰等。 4 DB 63/T 1968—2021 AA 附 录 A （规范性附录） 野生动物疫病检测采样（送检）单 表A.1给出了野生动物疫病检测采样（送检）单 表A.1 野生动物疫病检测采样（送检）单 样品 动物 样品 样品 采样地址 动物发病 编号 名称 种类 数量 （坐标） 死亡时间 采样单位： 采样人： 临床症状 预检项目 备注 采样日期： _________________________________ 5