ICS CCS 65.020.30 B 41 33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2405—2021 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双 重荧光 RT-PCR 检测方法 Dual real-time RT-PCR method for detection of porcine deltacoronavirus and porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 （本稿完成日期：） 2021 - 12 - 12 发布 浙江省市场监督管理局 2022 - 01 - 12 实施 发 布 DB33/T 2405—2021 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江大学、浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：赵灵燕、冯肖肖、吴贇竑、李肖梁、方维焕、单颖、谢荣辉、徐计东、毕淑珍、 刘爱军、吴雪军、黄晓兵、周蕾、章杭建。 I DB33/T 2405—2021 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的术语和定义、缩略 语、仪器、耗材和试剂、样品采集和处理、荧光RT-PCR操作程序、结果判定及生物安全措施。 本标准适用于猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction），将RNA的反转录 (RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 β-Actin：肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，其在不同物种之间高度保守，是PCR常用的内 部参照。 Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold）。 DEPC：焦磷酸二乙酯（diethyipyocarbonate）。 DNA酶：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）。 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution）。 PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus）。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus）。 1 DB33/T 2405—2021 RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）。 RNA酶：核糖核酸酶（ribonuclease）。 RT-Enzyme Solution：反转录酶溶液（reverse transcription enzyme solution）。 Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）。 Taqman探针：一种检测寡核苷酸的荧光探针。 TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（tris-EDTA buffer）。 5 仪器 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 荧光 PCR 检测仪。 高速台式冷冻离心机：可控温至 4 ℃、离心速度可达 12 000 r/min 以上。 组织研磨器或者研钵。 分析天平。 生物安全柜。 冰箱：可温控在 2 ℃～8 ℃和-20 ℃～-40 ℃。 超低温冰箱：可控温至-70 ℃以下。 微量移液器：2 µL、10 µL、100 µL、200 µL、1 000 µL，并配备与移液器匹配的吸头。 高压灭菌锅和干燥箱：可温控至 160 ℃。 6 耗材和试剂 6.1 无 RNA 酶的 1.5 mL 离心管。 6.2 无 RNA 酶的 0.2 mL PCR 管或八联管及各种规格吸头。 6.3 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 6.4 Trizol：商品化 RNA 抽提试剂，2 ℃～8 ℃保存。 6.5 RNA 提取试剂盒：商品化 RNA 病毒核酸提取试剂盒。 6.6 氯仿和异丙醇：-20 ℃预冷。 6.7 75%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20 ℃预冷。 6.8 DEPC 水：参照附录 A 配制，也可购买商品化 DEPC 水。 6.9 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）：参照附录 A 配制，也可购买商品化 PBS。 6.10 引物和 TaqMan 探针：其序列见附录 B，由生物公司合成，用 TE 溶液溶解并稀释至 100 µmol/L 存储液，-20 ℃保存备用；根据需要配制成 10 µmol/L 工作液，-20 ℃保存供检测使用。 6.11 病毒阳性对照和阴性对照：猪德尔塔冠状阳性对照样品和猪流行性腹泻阳性对照样品分别为携带 检测靶序列的质粒（质粒及其检测靶序列见附录 C），阴性对照样品为空质粒。 6.12 内参对照阳性对照样品和阴性对照样品：内参对照阳性对照样品为带有猪β-actin 基因的质粒； 内参对照阴性对照样品为空质粒。 7 样品采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经121 ℃湿热灭菌30 min。 7.1.2 一次性无菌采样拭子和采样管。 2 DB33/T 2405—2021 7.1.3 组织研磨器或者研钵，经160 ℃干热灭菌2 h。 7.2 样品采集 7.2.1 粪便或肠内容物采集 将一次性无菌采样拭子用无菌PBS浸湿后，蘸取粪便或肠内容物（不少于0.5 g），置于无菌采样管 中备用。 7.2.2 肛拭子采集 大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，将一次性无菌采样拭子用无菌PBS浸湿后，探入直肠2 cm～3 cm、旋转3 次～5 次后，取出含有直肠内容物肛拭子，置于无菌采样管中备用。 7.2.3 组织样品采集 用7.1.1处理过的器械，取肠道组织（不少于5 g），置于无菌采样管中备用。 7.3 样品保存和运输 上述采集的样品宜立即进行检测。不能立即检测的样品，在2 ℃～8 ℃条件下保存不应超过24 h， -25 ℃～-15 ℃条件下保存应不超过1个月，-70 ℃以下条件保存应不超过6 个月。样品运送采用低温保 存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。 7.4 样品处理 7.4.1 粪便或肠内容物 取0.5 g～2.0 g粪便或肠溶物加入500 µL无菌PBS，冻融1次～2次，充分涡旋震荡1 min，于4 ℃下以 3 000 r/min转速离心5 min，取上清装于1.5 mL灭菌管，用于后续的核酸提取。 7.4.2 肛拭子 肛拭子采样管中加入500 µL无菌PBS，冻融1次～2次，充分涡旋震荡1 min，于4 ℃下以3 000 r/min 转速离心5 min，取上清装于1.5 mL灭菌管，用于后续的核酸提取。 7.4.3 组织样品 取1.0 g～2.0 g组织，剪碎，加入1 mL无菌PBS进行研磨，制备组织匀浆，冻融1次～2次，于4 ℃下 以8 000 r/min转速离心5 min，取上清装于1.5 ml灭菌管，用于后续的核酸提取。 8 荧光 RT-PCR 操作程序 8.1 RNA 提取 8.1.1 按下列步骤完成RNA提取，并用无RNA酶活性的DNA酶处理，也可采用商品化的病毒RNA提取试剂 盒。 8.1.2 取n个灭菌的1.5 mL离心管（n为待检样品数），对每个离心管进行编号。 8.1.3 每管加入750 µL Trizol，加入被检样品250 µL，用力上下反复颠倒数次或涡旋振荡30 s，静置5 min。再加入200 µL预冷的氯仿，震荡混匀，静置5 min，于4 ℃条件下以12 000 r/min转速离心15 min。 3 DB33/T 2405—2021 8.1.4 取与8.1.2中相同数量的灭菌1.5 mL离心管，并对每个离心管进行编号。取8.1.3中离心后的上 清液（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积预冷异丙醇，混匀，静置30 min。 8.1.5 于4 ℃条件下以12 000 r/min转速离心15 min，弃上清，缓缓加入1 mL 75%预冷乙醇，颠倒洗涤沉 淀及管壁。 8.1.6 于4 ℃条件下以12 000 r/min转速离心10 min，弃上清，室温条件下干燥后，加入30.0 µL DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管中的RNA，以4 000 r/min转速离心10 s，置于冰上保存备用。提取的RNA应在 2 h内进行荧光RT-PCR扩增，若需长期保存，应置于-70 ℃以下条件的冰箱保存。 8.2 荧光 RT-PCR 反应 8.2.1 反应体系的配制 在试剂配制区分别配制病毒检测反应体系和内参对照检测反应体系。病毒检测反应管数为n+3（n 为待检样品数，包括1份PEDV阳性对照、1份PDCoV阳性对照和1份阴性对照），反应体系组成见下表1。 内参对照检测反应管数为n+2（n为待检样品数，包括1份内参对照阳性对照和1份内参对照阴性对照）， 反应体系组成见下表2。各反应液体积宜按多1管进行配制，且在使用RT-Enzyme Solution时至少用1 µL。 配制反应液应在冰盒中进行。 表1 PDCoV 和 PEDV 双重荧光 RT-PCR 反应体系 组 分 1个检测反应的加入量/µL 2×RT-PCR Reaction Mix 10.0 200×RT-Enzyme Solution 0.1 PDCoV上游引物（PDVF） 0.4 PDCoV下游引物（PDVR） 0.4 PDCoV探 针（PDVP） 0.1 PEDV上游引物（PEDVF） 0.4 PEDV下游引物（PEDVR） 0.4 PEDV探 0.1 针（PEDVP） DEPC处理水 3.1 合计 15.0 表2 内参对照荧光 RT-PCR 反应体系 组 1个检测反应的加入量/µL 2×RT-PCR Re