ICS CCS 65.020.30 B 41 33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2492—2022 虾肝肠胞虫核酸检测技术规范 Technical specification for nucleic acid detection of Enterocytozoon hepatopenaei 2022 - 05 - 17 发布 浙江省市场监督管理局 2022 - 06 - 17 实施 发 布 DB33/T 2492—2022 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由浙江省水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省水产技术推广总站、浙江省休闲观赏渔业行业协会、杭州市农业技术推广 中心。 本标准主要起草人：朱凝瑜、郑晓叶、梁倩蓉、叶键、黄家庆、周凡、许婷、丁雪燕、吴洪喜。 I DB33/T 2492—2022 虾肝肠胞虫核酸检测技术规范 1 范围 本标准规定了虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）套式PCR检测、荧光定量PCR检测、 环介导等温扩增（LAMP）检测方法所需试剂和材料、仪器和设备，样品采集、样品前处理、操作步骤和 结果判定。 本标准适用于虾类、饵料生物、养殖水体等样品中虾肝肠胞虫的检测和监测，其他甲壳类和浮游动 物参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 本标准没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本标准 Bst DNA 聚合酶：嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase） bp：碱基对（base pair） Ct值：反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） EHP：虾肝肠胞虫（Enterocytozoon heppenatoaei） LAMP：环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification） PCR：聚合酶链反应（polymerase chain reaction） PEG：聚乙二醇（polyethylene glycol） SWP：孢子壁蛋白（spore wall protein） SYBR Green I qPCR Mix：含双链嵌合荧光染色剂的荧光定量PCR预混液 5 试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 1 DB33/T 2492—2022 5.1 无水乙醇。 5.2 95 %乙醇：95 mL 无水乙醇，加水定容至 100 mL。 5.3 70 %乙醇：70 mL 无水乙醇，加水定容至 100 mL。 5.4 0.45 μm 硝酸纤维素膜。 5.5 3 %牛肉膏洗脱液：30.0 g 牛肉浸膏加水溶解，调节 pH 至 9.0，定容至 1 000 mL，高压灭菌 15 min， 室温保存。 5.6 16 %PEG8 000：160.0 gPEG8 000、17.5 gNaCl 加水溶解，定容至 1 000 mL，高压灭菌 15 min，室温 保存。 5.7 磷酸氢二钠(Na2HPO4）（0.2 mol/L）：71.6 gNa2HPO4·12H2O 加水溶解，调节 pH 至 9.0，定容至 1 000 mL，高压灭菌 15 min，室温保存。 5.8 抽提缓冲液：1 mL1 mol/L Tris·HCl (pH8.0)、20 mL0.5 mol/L EDTA (pH8.0)、2 mL1 mg/mL 胰 RNA 酶、5 mL10 %SDS 加水溶解，定容至 100 mL，室温贮存。 5.9 蛋白酶 K（20 mg/mL）：-20 ℃保存。 5.10 This 平衡酚（饱和酚）、10 mol/L 乙酸铵、酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）、三氯甲烷/异戊 醇（24:1）。 5.11 TE 缓冲液：10 mL1 mol/L Tris·HCl (pH8.0)、2 mL0.5 mol/L EDTA（pH8.0）加水定容至 1 000 mL， 高压灭菌后 4 ℃保存。 5.12 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）：-20 ℃保存，避免反复冻融。 5.13 10×PCR 缓冲液：随 Taq DNA 聚合酶提供，-20 ℃保存。 5.14 氯化镁（MgCl2）溶液（25 mmol/L）：-20 ℃保存。 5.15 dNTP：生化试剂，含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L 的混合物，-20 ℃保存。 5.16 套式 PCR 引物：两对引物（F514 和 R514、F147 和 R147）序列及其在靶基因中的位置见附录 A 中的 A.1，-20 ℃保存。 5.17 1×TAE 电泳缓冲液：242 gTris、100 mL0.5 mol/LEDTA (pH8.0)、57.1 mL 冰乙酸，加水定容至 1 000 mL，室温保存，使用时稀释 50 倍。 5.18 琼脂糖：电泳级。 5.19 样品缓冲液：40 g 蔗糖加水溶解，定容至 1 000 mL，加入 0.25 g 溴酚蓝溶解后，4 ℃保存。 5.20 电泳核酸染料：溴化乙锭或 4S Green 等商品化染料。 5.21 DNA Marker2 000，-20 ℃保存。 5.22 SYBR Green I qPCR Mix。 5.23 荧光定量 PCR 引物：引物（F118 和 R118）序列及其在靶基因中的位置见附录 A 中的 A.2，-20 ℃ 保存。 5.24 10×thermolPol 缓冲液：含 200 mmol/L Tris·HCl(pH8.0)、100 mmol/L 硫酸铵（（NH4）2SO4）、 100 mmol/L 氯化钾（KCl）、20 mmol/L 硫酸镁（MgSO4）、1 % Triton X-100。 5.25 甜菜碱，5 mol/L。 5.26 MgSO4，150 mmol/L。 5.27 Bst DNA 聚合酶，8 U/µL。 5.28 LAMP 引物：三对引物（F3 和 B3、FIP 和 BIP、FLP 和 BLP）序列及其在靶基因中的位置见附录 A 中的 A.3，-20 ℃保存。 5.29 阳性对照：已知受 EHP 感染的对虾样品提取的 DNA，-20 ℃保存。 5.30 阴性对照：已知未受 EHP 感染的对虾样品提取的 DNA，-20 ℃保存。 5.31 空白对照：无菌双蒸水。 2 DB33/T 2492—2022 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 6.14 6.15 PCR 扩增仪。 荧光定量 PCR 仪。 恒温荧光扩增检测仪。 电泳仪：输出直流电压 0 V～600 V。 水平电泳槽：50 mL～500 mL，带有凝胶船及样孔梳。 微量移液器及适配吸头，建议使用带滤芯的吸头。 凝胶成像仪。 水浴锅或金属浴。 普通冰箱：具冷藏箱，并带-18 ℃以下冷冻箱体。 离心机：转速可达 12 000 r/min 以上。 超声波破碎仪：20 kHz±2 kHz。 0.2 mL PCR 管及 1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL 离心管：经高压灭菌，一次性使用。 无菌研磨棒：适用于 1.5 mL 离心管，经高压灭菌，一次性使用。 分析天平：最小分度值为 1 mg。 真空抽滤泵。 7 样品采集和处理 7.1 样品的采集 7.1.1 生物样品 7.1.1.1 样品采集的要求和数量按 SC/T 7103 的规定。 7.1.1.2 对虾受精卵、幼体、仔虾及体长 3 cm 以下稚虾取完整个体；幼虾至成虾取肝胰腺、肠道；卤 虫、丰年虫等饵料生物样品取完整个体，冷藏运输进行核酸抽提。或置于灭菌采样容器内，加入待检 样三倍体积的 95 %乙醇没过待检样，-20 ℃保存。 7.1.2 水样 用无菌容器采集500 mL，冷藏运输进行核酸抽提。或-20 ℃保存待检。 7.2 样品处理 7.2.1 通用要求 样品处理过程中应避免交叉污染。 7.2.2 生物样 将采集样品用研磨棒研磨均匀，取10 mg～100 mg组织匀浆液， 置于灭菌1.5 mL的离心管中，用于 核酸提取。 7.2.3 水样 7.2.3.1 取 100 mL 水样经 0.45 μm 硝酸纤维素膜抽滤后，取出硝酸纤维素膜并剪碎，放入装有 1.5 mL 的 3 %牛肉膏洗脱液及锆珠的 2 mL 离心管中，震荡 20 min～30 min，或用超声破碎仪破碎 15 min。 3 DB33/T 2492—2022 7.2.3.2 取出上清转移至无菌的 5 mL 离心管中。加入等体积的 16 % PEG8 000 溶液，震荡充分混匀， 调节 pH 至 7.0，4 ℃静置 3 h 或过夜。 7.2.3.3 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min，弃上清。加入 Na2HPO 4 500 μL，震荡至重悬沉淀。 7.2.3.4 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min，取上清用于核酸抽提。 8 核酸抽提 8.1 经 7.2 处理样品，按以下方法进行核酸抽提。 8.2 加入抽提缓冲液 450 μL、蛋白酶 K3 μL，混匀，56 ℃孵育 3 h。 8.3 冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 3 min，取上层水相至新 1.5 mL 离心管中。 8.4 加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1），颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 1 min，取 上层水相至新 1.5 mL 离心管中。 8.5 加溶液等体积三氯甲烷/异戊醇(24:1)，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 1 min，取上层水 相至新 1.5 mL 离心管中。 8.6 加入乙酸铵 100 μL，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20 ℃）混