ICS 65.020.20 CCS B 05 DB23 黑 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3169—2022 大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价 技术规程 2022-05-09 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-06-08 实施 发 布 DB23/T 3169—2022 前 言 本文件依据 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业农村厅提出。 本文件起草单位：黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所。 本标准主要起草人：王爽、孙磊、金品娇、李伟群、陈雪丽、万书明、刘凯、李一丹、孙秀君。 I DB23/T 3169—2022 大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术规程 1 范围 本文件规定了大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术的术语和定义、结瘤能力评价与固氮效 果评价的方法。 本文件适用于外源接种大豆根瘤菌的效果评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 NY/T 2066-2011 微生物肥料生产菌株的鉴别 聚合酶链式反应（PCR）法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 占瘤率 应用特定根瘤菌株接种豆科植物与土著根瘤菌竞争结瘤,在竞争中特定根瘤菌结瘤数占总瘤数的百 分数称为占瘤率。占瘤率是评估接种根瘤菌相对土著根瘤菌的竞争结瘤能力的重要参数。 3.2 竞争结瘤能力 根瘤菌能够在宿主豆科植物上形成根瘤，而且它在其他根瘤菌存在的情况下，也能与相同的豆科植 物结瘤的能力，叫做竞争结瘤能力。 3.3 固氮能力 固氮能力是根瘤菌将分子态氮还原成氨和其他含氮化合物的能力，通过对比接种待测菌株与未接种 处理的根瘤固氮酶活性和植株全氮含量来评价。 4 结瘤能力评价 4.1 一般要求 实验室操作人员应具备良好的分子生物学专业技能，操作熟练。有毒、有害、废弃物的处理及安全 防护应符合GB/T 19495.2的要求。 1 DB23/T 3169—2022 4.2 原理 利用BOX-PCR指纹图谱比较，检测接种根瘤菌菌株的占瘤率，以此评价供试菌株相对于土著根瘤菌 的竞争结瘤能力；根据根瘤固氮酶活性和大豆植株全氮含量，协同评价根瘤菌的固氮能力。 4.3 主要材料与用具 铁锹、小铲、镊子、记号笔、塑料袋、剪刀、冰盒、小型离心机、微量可调移液器及对应的无菌 Tip 头、1.5 mL 无菌离心管、振荡培养箱（摇床）、静置培养箱、高压蒸汽灭菌锅、分光光度计、细菌 基因组 DNA 提取试剂盒、超净工作台、PCR 仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像分析仪等。 4.4 占瘤率测定方法 4.4.1 蛭石盆栽实验中根瘤菌占瘤率的测定 根瘤菌占瘤率的测定按照如下程序进行： a） 大豆种子的处理 精选无病、饱满、大小一致的大豆种子，经过75%酒精处理2 min、20%次氯酸钠处理5 min、无菌水 水洗3次后置于1%水琼脂培养基上培养，待其萌芽后种植于灭菌的蛭石中，进行蛭石盆栽培养，每盆3 粒～4粒大豆种子。 b） 根瘤菌接种 将根瘤菌接种于YMA培养基（配方见附录A）上，5 d后用生理盐水将菌体洗下来。待大豆对生真叶 展开时，将上述菌悬液接种于根部，每盆约5 mL菌液（OD600=1.0），每个菌株接种3棵～4棵植株。以不 接种无菌生理盐水的大豆为阴性对照。 c） 根瘤中收获类菌体 蛭石盆栽培养45 d后收获根瘤，每个盆中随机挑取3个～5个根瘤，分别用75%乙醇消毒1 min、15% 次氯酸钠消毒3 min、无菌水水洗3次后置于灭菌的EP管中，用灭菌的镊子将根瘤捣碎后，使根瘤内汁液 流出，去除植物根瘤组织后，加入10 μL的无菌水，13000 rpm离心3 min，保留沉淀，即为收获的类菌 体。 d） 类菌体DNA的制备 在上述收获的类菌体中加入10 μL无菌水充分悬浮类菌体，混匀后于沸水中煮沸5 min，然后迅速 移入冰上冰浴5 min，随后进行13000 rpm离心3 min，取上清液，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书 提取根瘤菌基因组DNA，即为类菌体DNA模板。 e） BOX-PCR扩增 以接种菌株的基因组DNA为对照进行BOX-PCR，接种菌株的DNA提取方法按照GB/T 19495.3-2004附录 A.4中的规定执行，BOX-PCR扩增体系及扩增反应程序见附录B。 f） BOX-PCR产物的检测：电泳结束后在凝胶成像分析仪中扫描凝胶，将指纹图谱用TIFF文件保存， PCR产物电泳图谱带型按照NY/T 2066-2011中5.6和6.2规定的方法进行检测与判定。 4.4.2 土壤盆栽试验中根瘤菌占瘤率的测定 以土壤作为大豆生产的基质，按照上述方法进行土壤盆栽试验，从根际随机挑取20个根瘤并进行根 瘤表面消毒，无菌水清洗后，按照上述方法进行BOX-PCR扩增及图谱分析。 4.4.3 结果分析 对比分离根瘤菌与接种菌种的BOX-PCR指纹图谱，达到100%相似水平时即可定位同一类BOX图谱类 型，统计各类型的菌株数量，占空白对照所分离的根瘤菌菌株的比例即为属于该类型的根瘤菌的占瘤率。 2 DB23/T 3169—2022 5 固氮效果评价 5.1 材料与工具 大豆盛花期植株根瘤样品，102G型气相色谱仪，标准乙烯（灵敏度为103，衰减1/128），待测样品 中乙烯（灵敏度为104，衰减1/1），乙炔（C2H2）气体，100 mL带有异丁基胶塞的血清瓶，注射器（1 mL、 10 mL密封性能好的），100 μL微量注射器。 5.2 固氮酶活性测定 采用乙炔还原法测定大豆根瘤菌固氮酶活性：取样计数后将鲜根瘤称重，收集到100 mL血清瓶中， 立即用异丁基胶塞密封，然后按瓶子中气相体积用注射器从瓶中抽空5%～10%的空气，再用注射器注入 等体积的C2H2，28 ºC保温2 h。取出瓶子，用注射器吸出100 mL的混合气体，用气相色谱仪以外标法测 定其固氮酶活性。计算公式如下： U n mt 式中： U ——根瘤固氮酶活性 nmol/mg/h； n ——乙烯含量 nmol； m ——根瘤鲜重 mg； t ——反应时间 h。 5.3 全氮含量测定 植物全氮含量计算公式如下： W c  V 2  V 1 0.014 m  V3  V 1000 式中： W ——植株全氮含量 g/kg； c ——硫酸标准溶液的浓度 0.01 moL/L； V1 ——空白滴定消耗标准液量 mL； V2 ——试剂滴定消耗标准液量 mL； V3 ——上机测试液量10 mL； m ——样品质量 g； V ——消煮后定容液量100 mL； 0.014 ——氮的毫摩尔质量 g/mmoL。 3 DB23/T 3169—2022 附录A （规范性） 培养基配方 A.1 YMA 培养基配方 甘露醇，10.0 g；酵母粉，0.8 g；K2HPO4，0.25 g；KH2PO4，0.25 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；NaCl， 0.1 g；0.25%溴麝香草酚蓝（仅在从根瘤中分离根瘤菌时选择性的加入），1 mL；琼脂，15 g～18 g； 蒸馏水，1000 mL；pH 值，6.8～7.0。 4 DB23/T 3169—2022 附录B （规范性） BOX-PCR 扩增体系及扩增反应程序 B.1 BOX-PCR 引物 BOX-A1R：5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’。 B.2 扩增体系为25.0 μL -1 -1 10×Reaction Buffer， 2.5 μL；MgCl2（20 mmolL ），5.6 μL；BSA（10 mgmL ），0.2 μL； -1 -1 4×dNTP（10 mmolL ），2.0 μL；100% DMSO，2.5 μL；BOX Primer（30 μmolL ），0.32 μL； -1 -1 模板DNA（100 ngμL ），1.0 μL；Tag DNA聚合酶（5 UμL ），1.0 μL；ddH2O补足至25.0 μL。 B.3 BOX-PCR扩增程序 95 ºC预变性2 min，[94 ºC变性1 min，52 ºC退火1 min，65 ºC延伸8 min]30个循环，65 ºC最终延 伸18 min，PCR产物40 ºC暂存5 min。 5