ICS 65. 120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23881—2009 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 Determination of feed cellulase activity- Filter paper assay method 2009-10-01实施 2009-05-26发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 23881—2009 前言 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）。 本标准主要起草人：何凤琴、杨林、钱防、刘小敏、屈利文、黄婷、颜克亮 GB/T23881—2009 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 1范围 本标准规定了以滤纸为底物，用还原糖比色法测定饲用纤维素酶活性的方法。 本标准适用于饲用纤维素酶活性的测定，定量检测限为0.02U/mL。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6682分析实验用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 滤纸纤维素酶活性单位 filter paper cellulase activity unit 在37℃，pH5.5，反应60min的条件下，每分钟降解滤纸释放1μmol葡萄糖所需的酶量，定义为 二个滤纸纤维素酶活性单位，以U表示。 4原理 纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸还原， 生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大吸收，在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应 液的吸光值成正比。 5试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。 5.1酒石酸钾钠（C,H,KNaO。·4H,O)。 5.2苯酚。 5.3亚硫酸钠。 5.4氢氧化钠溶液（200g/L）：称取氢氧化钠20.0g，加100mL水溶解。 5.5柠檬酸溶液（0.1mol/L)：称取柠檬酸（CH.O·H,O)2.10g，加水溶解定容至100mL。 100 mL。 5.7柠檬酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH5.5)：称取柠檬酸（C.HsO·HzO)10.5g加人氢氧化钠5.0g， 再加800mL水溶解，用柠檬酸溶液（5.5）或柠檬酸钠溶液（5.6）调节pH至5.5，再用水定容至 1 000 mL. SAG 1 GB/T23881—2009 5.8Whatman1号滤纸条(1.0cmX6.0cm)。 5.9DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加人氢 氧化钠溶液（5.4)100mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加人酒石酸钾钠（5.1)91.0g、苯酚 （5.2)2.50g和亚硫酸钠（5.3)2.50g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至1000mL。过滤，取滤液贮 存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。 警告：处理酸碱和配制DNS试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手 套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。 5.10葡萄糖标准溶液（10.0mg/mL）：称取经105℃烘至恒量的无水葡萄糖约1g，精确至0.0001g， 加柠檬酸盐缓冲溶液（5.7）溶解，定容至100mL。 6仪器与设备 除常用实验室设备外，其他仪器设备如下。 6.1分样筛：孔径为0.25mm（60日）。 6.2分析天平：感量为0.0001g。 6.3pH计：精确至0.01。 6.4磁力搅拌器：附加热功能。 6.5电磁振荡器。 6.6离心机。 6.7恒温水浴锅。 6.8秒表。 6.9分光光度计。 6.10移液器：精度为1μL。 7试样的制备 按GB/T14699.1采样，按GB/T20195选取样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过 0.25mm孔筛，混勾密闭容器中，低温保存。 8测定 8.1试样溶液的准备 称取0.2g～4g试样，精确至0.0001g，加入40mL柠檬酸盐缓冲液（5.7），磁力搅拌30min，再 用柠檬酸盐缓冲液（5.7）定容至100mL，在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取30mL~50mL，以 中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL～0.18U/mL之间）。 液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液（5.7）进行稀释，定容（稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制 在0.04U/mL～0.18U/mL之间）。如果稀释后的酶液pH偏离5.5，需重新调节pH为5.5，用柠檬 酸盐缓冲液（5.7)稀释定容。 8.2标准曲线 8.2.1分别量取葡萄糖标准溶液（5.10)0.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、 10.00mL，分别用柠檬酸盐缓冲溶液（5.7）定容至50mL，配成浓度为0.00mg/mL~2.00mg/mL的 葡萄糖标准系列。 8.2.2分别吸取葡萄糖标准溶液（8.2.1)各1.00mL于25mL容量瓶中，各加2.00mL水和2.00mL DNS试剂（5.9），沸水浴5min。冷却至室温，用水定容至25mL，在540nm波长下比色，以吸光度作横 坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程。 2 GB/T23881—2009 8.3酶活性的测定 8.3.1吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（8.1）,37℃平衡10min。 8.3.2在25mL具塞比色管中加入滤纸条（5.8）——滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL 柠檬酸盐缓冲液（5.7）浸润滤纸片，37C水浴平衡10min，再依次加入2.00mLDNS试剂（5.9）， 0.50mL酶液（8.3.1），5mL水，电磁振荡3s5s，37℃水浴中保温60min（用秒表控制），然后在沸水 浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL，在540nm波长处测定校准值A。。 8.3.3在25mL具塞比色管中加人滤纸条（5.8）一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL 柠檬酸盐缓冲液（5.7）浸润滤纸片，37℃水浴平衡10min，再依次加人0.50mL酶液（8.3.1），5mL水， 电磁振荡3s~5s，37℃水浴中保温60min（用秒表控制），加2.00mLDNS试剂（5.9），然后在沸水浴 中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL。在540nm波长处测定吸光度Ar。 9结果计算 9.1试样中滤纸纤维素酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克(U/g）,按式(1)计算： X1000Xn .(1) 式(1)中： X——试样纤维素酶的活性，单位为酶活性单位每克（U/g）； m一一根据标准曲线方程上计算得的（Ai一A。）值对应的葡萄糖的质量，单位为毫克（mg）； M葡萄糖的摩尔质量180.2g/mol； t——酶解反应时间,单位为分钟(min); 1000——转化因子，1mmol=1000μmol; 试样的总稀释倍数。 7 9.2每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留3位有效数字。 10重复性 在重复性条件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过20%。